膝关节骨性关节炎动物模型建立的研究现状

宋寒冰++++++赵峰++++++葛圆圆2++++++杨丹++++++于英君

[摘要] 本文基于对膝关节骨性关节炎病因和治疗机制的基础研究的不断探索，深入分析发现当前建立骨关节炎动物模型所选动物以鼠、兔为主，其他动物如狗、猪、鸡等应用较少。常用造模方法主要有自发性模型、手术造模以及其他方法等，不同动物及不同方法有着较为严格的区别，因此在选择模型时应根据研究需要综合考虑。

[关键词] 膝关节；骨关节炎；动物模型

[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（c）-0046-04

Research status of establishment of animal model of knee osteoarthritis

SONG Hanbing1 ZHAO Feng2 GE Yuanyuan2 YANG Dan2 YU Yingjun3▲

1.The Third Department of Orthopaedics， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 2.Graduate School， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 3.School of Basic Medicine， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China

[Abstract] Based on the continuous exploration on the fundamental researches of etiology and treatment mechanism of knee osteoarthritis， this paper takes in-depth analysis and finds that the animals used for establishing animal models with osteoarthritis at present are mainly rats and rabbits， the application of other animals， such as dogs， pigs， chickens and others， is less. The commonly model replicating methods are spontaneous models， operation models， and other methods， different animals and different methods have relatively strict distinction， so the choice of models should be based on the need of study.

[Key words] Knee joint； Osteoarthritis； Animal model

膝关节骨性关节炎是在骨科临床中常见的一种以关节退行性改变为主的疾病，中老年人群多发，主要症状为膝关节增生样肿胀、关节内翻畸形、屈伸活动受限，负重行走尤其上下楼梯时疼痛明显加重，关节磨糙音、弹响，部分患者会出现关节腔积液[1]。目前，对于膝关节骨性关节炎的临床和基础研究越来越广泛，但是膝骨性关节炎发生的病因和治疗机制的基础研究尚不丰富，有待于进一步的探索。在试验过程中，能够制造最为接近人的膝关节骨性关节炎的病因及转归的动物模型则尤其重要。

经过造模方法的不断深入研究，膝关节骨性关节炎的造模方法较多，利用兔和大鼠来造模的方式是最为常见的，动物模型一般有自发性模型、诱发性模型、手术方法造模等。为了能够更顺利地完成膝关节骨性关节炎的相关动物实验，在目前文献研究报道的基础上，本文总结了动物模型的常见建立方法，以利于研究者能够更顺利地运用膝关节骨性关节炎动物模型来进行实验研究。

1 鼠类模型的制作

1.1 喂养造模

Silberberg等[2]给以含高脂肪、高动物油脂的饲料喂养C57BL小鼠，经过研究发现骨关节炎出现率较高，脂肪酸Omega-3代替必需脂肪酸Omega-6可导致关节软骨纤维的退行性改变。

1.2 自发性模型

许多动物可以因自身关节软骨退变形成骨关节炎，这种骨关节炎甚至不需任何干预。由Silberberg等[3]经过观察发现C57黑鼠和STRPort小鼠具有可以自我发生骨性关节炎的特征，主要累及胫内侧软骨，雄性STRPort小鼠病变较重，发生率较高[4]。激素水平影响可以产生自发性模型，研究發现性激素可以干预雌性STRPort小鼠转化生长因子β1与白介素-4表达，此效应可以保护关节软骨，降低关节软骨炎的发生率[5]。另外，Yamamoto等[6]通过对栗鼠行走方式进行干预，使其以特殊的步态行走，发现当栗鼠以这种步态行走一段时间后，栗鼠踝关节软骨的边缘会出现不同程度的增生、关节面龟裂等形态变化，光镜观察可以发现，栗鼠关节产生类似于人类骨关节炎病理变化的改变，如软骨细胞数目减少、排列紊乱等。这些改变可以进行类似骨关节病遗传学及关节软骨细胞退行性改变方面的研究[7]。

1.3 基因技术模型

转基因技术的不断创新，骨关节炎动物模型可以通过基因技术来实现，目前主要是Col9a1和Col2a1基因部分缩短、缺失或者基因的突变、铜转运基因缺陷、Col11a1基因的1-bp处缺失、MMP-13基因的过度表达以及组织特异性BMP-1a型受体缺乏等，以及下列基因的敲除，这些基因包括ADAM-15基因、MMP-14基因、白介素-6基因、Mig-6基因、a-1整合素基因、纤维调节素和基膜聚糖基因双链、纤维调节素和二聚糖基因单链或者双链等。研究发现，调控软骨细胞凋亡的基因被剔除，软骨细胞退变，破坏速度会加速[8]。Arita等[9]发现并制造转基因小鼠模型，表达人突变Ⅱ型前胶原基因，电镜下发现相比于正常组，软骨示Ⅱ型胶原纤维的密度减少，此等变化与因该基因突变而造成的全身骨关节炎患者相似。endprint

虽然转基因小鼠骨关节炎模型对于研究骨关节炎发病中的特殊基因或蛋白质的作用十分重要，然而骨关节炎的发病机制是基因的异常，并不能反映临床上因劳累、环境因素等造成的关节炎，另外，进行基因改造后的实验动物是否具有其他可引起关节改变的病理变化尚不明确，因此转基因能否作为评价骨关节炎治疗方法的普通模型还存在争议。

1.4 关节固定

如果将大鼠关节较长时间固定，可以导致关节软骨的退变，从而产生关节炎。如果固定于关节伸直位时施加压力可以加大关节面压力和磨损，从而促进关节炎发生的进程。另有学者通过采用过屈位和过伸位将模型进行固定，发现两者均能得到满意的动物模型，但过屈位造模方法优于过伸位所造的模型[10]。

1.5 关节注射

卢锋等[11]将白陶土的生理盐水悬浮液和弗式佐剂注射液分别注射于大鼠后肢踝趾关节，用来观察盐酸氨基葡萄糖抑制骨关节炎的病变程度，结果显示盐酸氨基葡萄糖对骨性关节炎存在保护作用，具有辅助性疗效。Hagmann等[12]对雄性Wistar大鼠的膝关节注射碘乙酸钠，建立膝关节骨性关节炎模型，该方法比较简便。

1.6 Hulth法造模

在动物实验中，早期曾有关节内手术方法，但关节内手术方法容易导致创伤性滑膜炎对实验的干扰，因此目前较为常用的手术方法为Hulth法，采用Hulth法制作鼠类动物模型，首先将膝关节的内侧副韧带离断，然后把内侧半月板和前后交叉韧带依次切除，饲养8周后即可成功制作出所需要的动物模型。例如有学者报道，将4～5个月龄大鼠以上述方法制得模型[13]。有学者[14]选择豚鼠作为实验动物进行研究，方法主要是切断豚鼠的臀大肌和深面臀小肌、臀中肌，来对髋关节的平衡维持能力、稳定能力以及负重能力进行干预性破坏。12周之后，研究人员发现其膝关节的软骨面出现水平裂隙及软骨剥脱等早期骨关节炎的典型表现，软骨细胞形成灶巢样增生、双柱状病理改变，可以见到新骨的形成。豚鼠关节软骨表面在24周之后，可以观察到破溃更加严重，呈绒毛样外观，裂隙加深，软骨下骨常常呈象牙状裸露。这种造模通常不会造成创伤性滑膜炎，因此可以作为骨关节炎早期病理变化的较好模型。

1.7 诱发性模型

寒冷刺激诱发模型、药物诱发模型是诱发性模型的两种主要类型，其中药物诱发模型主要的造模方式是药物的关节腔内注射，常用的药物主要有雌激素、蛋白水解酶、肾上腺皮质激素、尿激酶、肿瘤坏死因子、白介素等，由于这些药物影响了膝关节软骨的代谢，直接对关节软骨造成了破坏，因而诱发骨关节炎。

寒冷刺激可以诱发关节液成分的改变，进一步改变滑膜通透性，对关节软骨的内环境造成破坏，可诱发关节炎。此外，寒冷刺激可以造成关节软骨的直接损伤，研究发现，局部冻疮6个月后可发现诱发关节软骨微小的损伤，12个月后可以观察到关节更加显著的损伤[15]，因此可以说明，关节损伤后常在受伤的数月后或数年后发生关节疼痛，尤其是在冬季容易加重。林木南等[16]在研究中指出，寒冷刺激可以使细胞排列紊乱，细胞显著簇集，可见细胞核缩、核溶、甚至细胞消失等现象，基质染色不均、淡染，导致结构明显疏松，胶原纤维显著减少，新生毛细血管出现在软骨中，软骨退化现象十分显著。

关节软骨及其附近的内环境十分脆弱，即使只是每日多次注射10%盐水，就算是生理盐水也可以诱发骨关节炎。因而得知，关节内环境的改变影响了关节软骨代谢，两者关系十分密切，这种微创非特异性造模方法也可以作为较理想的造模方法用于研究药物对膝关节病的治疗。

1.8 其他方法造模

刘安军等[17]根据长期低温环境可导致关节炎的理论，采用冷水（温度约为4℃）对小鼠冷冻刺激方式进行膝关节造模。在造模后的第30天，觀察小鼠的膝关节的状态并对其肿胀程度评分，提取膝关节软骨组织作标本，检测其血清中透明质酸水平以及肿瘤坏死因子含量。第30天时发现模型组小鼠关节炎指数（AI）远高于正常组，最高可达3.8，对模型小鼠进行苏木精-伊红染色，可见小鼠典型的骨关节炎病变，模型组血清中透明质酸、肿瘤坏死因子-α的含量显著升高，出现骨关节炎典型的病理改变，而且其血清中肿瘤坏死因子和透明质酸的含量都可见明显升高，说明冷水刺激可导致小鼠骨关节炎，这种造模方法可作为具有地域特异性的骨关节炎模型。

有学者发现，小鼠在行卵巢切除术后会出现明显的关节软骨退变，而且代表软骨变化的CTX2Ⅱ和代表骨吸收的CTX2Ⅰ显著升高[18]。这表明，关节变化与CTX2Ⅱ和CTX2Ⅰ的水平呈明显相关性，这说明了卵巢分泌的一类激素可以对关节软骨起到一定的保护作用，并且得出卵巢切除术可用于激素水平及年龄相关的骨关节炎动物模型。

2 兔模型的制作

2.1 Hulth法造模

兔模型也多以Hulth法为主，兔Hulth法[19]为兔经典手术干预造模方法，其方法大致为：以耳缘静脉麻醉法麻醉实验兔，实验组是将兔的膝关节皮下组织切开，将内侧副韧带、前后交叉韧带切断，把内侧半月板一同完整切除，术后常规处理，固定但不制动伤肢，1周后每天驱赶兔子行走2次，共30 min，连续4周。当实验兔因手术导致膝关节正常力线破坏时，关节负重面减少，局部受力更加集中，导致关节软骨磨损程度增加，加重了其退行性变的速度，促使关节软骨发生退行性改变。3个月后对实验兔受损关节的观察显示，软骨出现裂隙、破坏[20]。

对实验兔采用Hulth造模法进行实验时，骨关节常常会出现类似骨关节炎中晚期的改变，病变较重，因此学者往往对其进行改良，例如李炳辉等[21]应用改良Hulth法进行实验造模，其主要步骤为将实验兔下肢内侧副韧带、内侧半月板以及前交叉韧带切断，在Hulth法操作中保留后交叉韧带，自术后1周每天驱赶实验兔行走30 min，并持续16周。16周后可同样发现实验兔的膝关节内侧关节间隙不同程度的变窄，关节面明显不平，边缘骨赘形成，细胞检测可见软骨胞膜破损，细胞核固缩。相对于传统Hulth法，改良后创伤较小，操作简单，一定程度上维持了膝关节的稳定性，更有利于造模成功。endprint

2.2 其他造模方法

除了Hulth法之外，李钊等[22]使用小针刀在20只实验大兔胫骨平台、双侧股骨髁软骨表面上刻痕，每一侧刻痕均为4～5道，刻痕不超过软骨层，不能损伤半月板，术后第2天开始每天驱赶动物活动半小时。由于小针刀闭合刻痕对关节滑膜影响小，故该方法不会出现滑膜炎等。该方法5周后发现造模组关节软骨具有典型的骨关节炎病理改变。

Okazaki等[23]通过将实验兔下肢关节伸直位制动持续14 d后，兔关节的软骨可以见到早期退变改变，制动28 d后可见到关节软骨退变程度达中度，42 d后则可达重度退变，同时发现p53 mRNA参与该过程的发生。一份实验[24]以成年新西兰大白兔为实验动物，将其左后肢膝关节固定于伸直位，造模6周后对比其左右后肢关节软骨及滑膜发现，关节软骨细胞在制动后1周即开始发生凋亡，6周时无论从微观或宏观角度，实验兔手术关节均符合呈典型的骨关节炎病理改变特征。

3 其他动物模型的制作

相比于上述实验动物，因实验动物伦理要求，其他模型在实践中应用相对较少，仅仅在某些特殊方法时才考虑应用。有学者尝试以关节镜切除猪双膝外侧部分半月板，术后12周时大体观察结果表现为局限性软骨表面纤维化，伴股骨髁间切迹骨赘形成；组织学检测表现为软骨细胞数量和蛋白多糖含量减少、成簇排列细胞数量增加，说明已产生退行性变；核磁检查表现为软骨厚度变薄、软骨信号强度改变[25]。因此以关节镜行半月板部分切除能有效建立猪双膝关节骨性关节炎动物模型，但因关节镜设备限制，关节镜造模仅在大型动物中可以应用。

易彩霞[26]尝试以猪为实验对象进行造模，其方法为取外侧入路进入猪左膝关节腔，将其前交叉韧带切断后并完全将外侧半月板切除。右侧膝关节不予处理作为空白对照侧。以手术方式建立以猪为实验对象的活体骨关节炎动物模型，观察关节软骨退变的不同阶段和T1ρ和T2mapping成像变化。然后分析胶原含量（软骨番红O染色和Van Gieson染色后所测OD值）、T2值、T1ρ值蛋白多糖（PG）含量，并分析它们之间的相关关系。此方法由于几乎完全不同于以前的任何研究方法，与临床的实际情况更加接近，其结论为：退变的软骨T2值、T1ρ值的改变与退变软骨中蛋白多糖含量和胶原含量的改变相关。在检测蛋白多糖含量时，与T2mapping比较，T1ρ成像更为敏感；而在检测胶原含量的过程中，T2mapping更敏感。

因实验兔关节内划痕可造成滑膜损伤，因此为了避免这一点，Marijnissen等[27]提出一种新的关节刻痕造模方法，以狗为实验动物，在不损伤软骨下骨的前提下，在狗的膝关节软骨上用圆绞刀人为造成软骨划痕，术后将对侧肢体限制活动，并以术肢负重活动，每周3 d，每天4 h，持续20周。造模后发现关节软骨局部可出现明显变性的软骨细胞、基质中异染物质消失等类似人类临床中膝关节骨性关节炎的病理改变，且关节炎症相对轻微，因此这种方法可作为一个观察骨关节炎早期表现及治疗效果的理想模型。另外，刘媛等[28]以鸡为实验动物，对其膝关节进行冰水浴，每天冰浴2 h，共进行30 d，然后利用电镜扫描进行观察，可以发现软骨表面出现波浪状低平的病理性结构，拱形结构明显消失，表面部分出现断裂，出现软骨细胞及胶原纤维裸露等退行性改变。

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（收稿日期：2017-06-21 本文编辑：张瑜杰）endprint