鸡Akirin2和GM-CSF促进传染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗免疫效果的研究

任广彩，刘传高，黄妙容，黄文科，钟楚红，刘郁夫，陈瑞爱,*

(1.肇庆大华农生物药品有限公司，广东肇庆 526238；2.华南农业大学兽医学院，广东广州 510642)

鸡Akirin2和GM-CSF促进传染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗免疫效果的研究

任广彩1，刘传高2，黄妙容1，黄文科1，钟楚红2，刘郁夫2，陈瑞爱1,2*

(1.肇庆大华农生物药品有限公司，广东肇庆 526238；2.华南农业大学兽医学院，广东广州 510642)

为提高鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗的免疫效力，将IBDV VP2、鸡Akirin2和鸡GM-CSF三基因编码区串联后克隆到真核表达载体pTriEx-4上，用构建的pT-VP2-Akirin2-GM-CSF重组质粒体外转染293T细胞，然后提取表达产物进行SDS-PAGE分析。结果在58、35、22 ku附近各有一蛋白条带。用pT-VP2-Akirin2-GM-CSF免疫SPF鸡，加强免疫2周后，攻IBDV BC6-85强毒，4 d后统计保护率。结果发现，注射14 d后，pT-VP2-Akirin2-GM-CSF质粒免疫组血清中能检测到特异性IBDV抗体和IBDV中和抗体，第28天，该组鸡的抗体滴度极显著高于空白对照组(P<0.01)，该组鸡外周血淋巴细胞增殖能力也极显著高于空白对照组(P<0.01)。说明VP2-Akirin2-GM-CSF三基因串联DNA疫苗有很好的应用前景。

鸡传染性法氏囊病；VP2基因；鸡Akirin；鸡GM-CSF；DNA疫苗

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种免疫抑制性疾病，严重危害家禽养殖业健康发展[1]。20世纪80年代流行起来的致病力和抗原性大为不同的变异毒株和超强毒株，能突破传统疫苗和母源抗体的保护，使该病的防控形势更为严峻[2-4]。DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的第三代疫苗，在传染病的防控中显示出巨大的应用前景[5-6]。VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白，与病毒的抗原性[7]、免疫原性、毒力[8]、细胞嗜性和诱导细胞凋亡[9]等有关。目前IBDV的DNA疫苗或相关基因工程疫苗大多以VP2作为靶基因，免疫后能起到一定预防效果[10]，但效果有限，刺激动物机体产生的抗体水平低，保护力较弱。本研究选择鸡Akirin和鸡GM-CSF两种细胞因子作为免疫增强剂来构建IBD的DNA疫苗。

Goto A等[11]在2008年对果蝇细胞进行功能性全基因组的RNAi筛选时发现一种天然免疫蛋白Akirin，由201个氨基酸组成，在不同物种间高度保守。在人和牛、小鼠、大鼠、犬等哺乳动物中均发现存在Akirin1和Akirin2两个基因，且哺乳动物之间Akirin2的同源性明显高于Akirin1的同源性。鸡只有Akirin2基因， 在植物、细菌和酵母中未发现该基因[11]。研究表明，Akirin2在果蝇和小鼠的免疫炎症反应中起着重要作用，是天然免疫反应信号通路如Imd和TLR所必须的核内因子，并参与到NF-κB依赖的基因转录中，促进多种免疫应答基因的转录[11]。而且猪Akirin2的存在促进IL-6的表达，在获得性免疫中，IL-6能够刺激已经分化的B淋巴细胞的生长，因此，Akirin2与先天性免疫和获得性免疫均有关联。

GM-CSF不仅能刺激造血细胞增殖、分化、成熟,并从骨髓向外周的转移,而且能活化中性粒细胞、巨噬细胞及其他单个核细胞，在细胞因子网络中占有重要地位，在免疫反应中具有重要作用[12]，GM-CSF作为免疫佐剂具有很广阔的发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 胶回收试剂盒、去内毒素质粒大量抽提试剂盒,Omega Bio-Tek公司产品；限制性内切酶SacⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、PremixTaq酶、DNA Marker,TaKaRa公司产品；表达载体pTriEx-4 DNA，Merck Millipore公司产品； Lipofectamine LTX and Plus转染试剂，Invitrogen公司产品；Akirin2抗体和GM-CSF抗体，Santa Cruz公司产品；FITC标记的兔抗鸡IgG和羊抗兔IgG，Bioworld Technology公司产品；Protein Marker、RIPA强裂解液，碧云天公司产品；293T细胞、DF-1细胞、E.coliDH5α菌株，本实验室(农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室)保存；IBD抗体ELISA检测试剂盒，BioChek公司产品；IBDV BC6-85毒株及标准阳性血清，中国兽医药品监察所产品；IBD中等毒力B87株疫苗，广东温氏大华农生物科技有限公司提供；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.1.2 实验动物 14日龄SPF白来航鸡，购自广东温氏大华农生物科技有限公司禽蛋分公司。

1.2 方法

1.2.1 VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57重组质粒的合成 根据美国国家生物技术信息中心中的IBDV VP2(GenBank登录号AF508177)、鸡Akirin2(GenBank登录号NM-001193595)和鸡GM-CSF(GenBank登录号EU939770.1)三基因编码区进行序列优化后串联；优化方法为去掉后两个基因的终止密码子，且对IBDV VP2基因进行鸡的密码子偏好性优化。将上述IBDV VP2基因、鸡Akirin2基因和鸡GM-CSF基因串联形成VP2-Akirin2-GM-CSF序列；每相邻两个基因之间由linker片段进行连接。linker序列为连接肽Furin(CGAGCAAAGCGC)和2A(GGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCA)编码基因，将串联基因克隆到pUC57质粒，获得VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57重组质粒；VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57重组质粒基因序列委托苏州金维智生物科技有限公司合成，经测序正确后将质粒置于-20℃保存，菌种添加150 mL/L无菌甘油冻存于-80℃。

1.2.2 引物设计 根据VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57基因序列，分别设计扩增VP2、Akirin2、GM-CSF的引物对，引物序列如下：

VP2 F：5′-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3′,(下划线部分为SacⅠ酶切位点)；VP2 R：5′-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3′,(下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点)；Akirin2 F：5′-TTTGAGCTCATGGCTTGTGGTGCCACTCTC-3′,(下划线部分为SacⅠ酶切位点)；Akirin2 R：5′-CCCAAGCTTGGACACGTAGGAGGCGGGCTG-3′,(下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点);GM-CSF F：5′-CGCGAGCTCATGCATCACCATCACCATCAC-3′,(下划线部分为SacⅠ酶切位点);GM-CSF R：5′-CCCAAGCTTTTAGATGCAATCTTTTTCTTC-3′,(下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点)。

上述6条引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增体系和反应程序 采用50 μL PCR反应体系，包括：PremixTaq(5 U/μL)25 μL，VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC-57(20 ng/μL)5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各2.5 μL，最后用ddH2O补足至50 μL；然后在BioRad PCR仪上进行PCR扩增，反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃ 10 min；用VP2 F和VP2 R扩增VP2基因，Akirin2 F和Akirin2 R扩增Akirin2基因，GM-CSF F和GM-CSF R扩增GM-CSF基因，VP2 F和GM-CSF R引物扩增VP2-Akirin2-GM-CSF串联基因。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小。

1.2.4 pTVP2-Akirin2-GM-CSF的构建

1.2.4.1 酶切、连接 将扩增后的产物用琼脂糖凝胶电泳回收大小为2 532 bp的条带并纯化，获得目的基因。再将回收的目的基因进行SacⅠ和Hind Ⅲ双酶切：体系PCR回收产物16 μL，10×M buffer 2 μL，SacⅠ 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL；pTriEx-4载体双酶切体系：pTriEx-4载体0.5 μg，10×M buffer 2 μL，SacⅠ 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL，最后用ddH2O补足至20 μL。上述双酶切反应均在37℃水浴反应2 h。

将目的片段双酶切产物和pTriEx-4载体双酶切大片段16℃过夜连接，连接反应体系：目的基因双酶切回收产物6 μL，pTriEx-4载体双酶切大片段回收产物2 μL，10×Ligase buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL。

1.2.4.2 转化、鉴定 所得连接产物与100 μL大肠埃希菌DH5α感受态混匀后冰浴30 min，42℃热激90 s，立即置冰上放置10 min，加入预热至室温的LB液体培养基900 μL，在37℃恒温摇床上150 r/min培养1 h，5 000 r/min离心1 min，弃去900 μL培养上清，剩余100 μL用移液器混匀后均匀涂布于含100 μg/mL Amp的LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜；倒置培养过夜后的培养基平板上挑取单菌落接种于5 mL含100 μg/mL Amp的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床上200 r/min振荡培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，所得质粒用SacⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切鉴定，将鉴定正确的重组克隆进行测序验证，验证正确的质粒命名为pT-VP2-Akirin2-GM-CSF，质粒图谱如图1。

图1 质粒图谱Fig.1 Plasmid profile

将所得含有质粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF的大肠埃希菌扩增后，用去内毒素质粒提取试剂盒提取纯化，用微量分光光度计进行定量，然后用PBS调整DNA浓度为1 000 ng/μL。

1.2.5 SDS-PAGE检测 将pT-VP2-Akirin2-GM-CSF与适量Lipofectamine LTX充分混匀后加入铺有293T细胞的细胞培养板中，利用空载体(pTriEx-4)和3种单基因重组表达载体pT-VP2、pT-Akirin2、pT-GM-CSF(本实验室构建并测序正确)同时进行相应的对照试验。48 h后收集所培养的细胞，RIPA裂解液裂解获得蛋白。取少量蛋白加入5×SDS Loading buffer，以100 g/L分离胶和40 g/L浓缩胶进行SDS-PAGE电泳。

1.2.6 间接免疫荧光检测 将pT-VP2-Akirin2-GM-CSF与适量Lipofectamine LTX充分混匀后加入铺有293T细胞的细胞培养板中，37℃继续培养72 h后，弃掉培养基，以40 g/L多聚甲醛室温固定30 min；PBST洗涤3次并拍干后以1 000倍稀释的鸡IBDV阳性血清为一抗4℃孵育过夜；以PBST洗涤3次并拍干后与2 000倍稀释的FITC标记的兔抗鸡IgG 37℃孵育2 h；再次以PBST洗涤3次，置于荧光显微镜下观察。以相同的操作步骤检测Akirin2和GM-CSF的表达情况。

1.2.7 免疫攻毒保护试验 将14日龄SPF白来航鸡随机分组，共分为7组，每组20羽(表1)。将DNA浓度均为1 000 ng/μL的pT-VP2-Akirin2-GM-CSF质粒溶液和pT-VP2、pT-Akirin2、pT-GM-CSF、pTriEx-4四种对照质粒溶液200 μL对14日龄SPF白来航鸡进行腿部肌肉两点注射，并记为第0天，于第14天进行同样处理加强免疫。每天观察各组鸡的变化情况(采食活动、精神状态等)。于第28天，除空白对照组1外，其余各组均经口感染IBDV BC6/85病毒(接种量为2×104BID50/羽)，记录各组死亡情况。于第32天将存活鸡只全部处死并剖检，检查法氏囊的病变情况，法氏囊发黄、脓肿或萎缩视为发病，法氏囊外观粉红视为正常。试验过程中于第0天、第14天、第28天和第32天各组随机取5羽鸡进行翅下静脉采血分离血清,参照试剂盒说明检测血清中IBDV特异性抗体滴度和IBDV中和抗体滴度，并检测第28天各组试验鸡外周血淋巴细胞增殖能力。

表1 试验动物分组情况Table 1 Groups of experimental animals

1.2.8 间接ELISA检测血清IBDV抗体滴度 按照BioChek IBDV抗体检测试剂盒说明书，检测上述分离的鸡血清IBDV抗体滴度，根据公式S/P=(样品OD 405 nm-阴性对照OD 405 nm)/(阳性对照OD 405 nm-阴性对照OD 405 nm)，log10Titer=1.1×log10(S/P)+3.361，计算血清IBDV抗体滴度(Titer)，Titer≥391判定为IBDV抗体阳性。

1.2.9 IBDV中和抗体滴度检测 按Reed-Muench法计算TCID50。 二免后14 d，各组取5羽鸡血清，56 ℃水浴灭活30 min，冷却至室温使用。将待检血清进行2倍比连续稀释，各取100 μL分别与等体积的病毒悬液(200 TCID50)充分混匀，37 ℃作用1 h。用DMEM将DF-1细胞调整至1×105个/mL，铺入96孔板，100 μL/孔。取100 μL病毒-血清混合液加入到铺有细胞的96孔板中，均重复4孔。同时设立标准阳性血清对照、阴性血清对照、正常细胞对照和病毒对照。37℃、体积分数为5%的CO2继续培养5 d，每天观察并记录结果，按Reed-Muench法计算每个血清样品的中和抗体效价，并计算每组5个样品中和抗体效价的平均数，作为本试验组该日龄血清的中和抗体效价(GMT值)。

1.2.10 外周血淋巴细胞增殖试验(MTT法) 于首免后28 d，每组取5羽鸡翅下静脉采血肝素抗凝，利用鸡淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，以RPMI-1640培养基调整细胞密度至5×106个/mL，100 μL/孔铺入96孔板。以终浓度为5 μg/mL的ConA刺激48 h，MTT标记，经DMSO裂解后读取各孔在570 nm处的吸光值OD 570 nm，作为淋巴细胞增殖的指标。

2 结果

2.1 VP2、Akirin2、GM-CSF 3个基因的扩增结果

根据VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57基因序列，分别设计扩增VP2、Akirin2、GM-CSF的引物，以质粒为模板扩增相应的目的基因，琼脂糖凝胶电泳显示大小分别为1 374 bp(VP2)、591 bp(Akirin2)、453 bp(GM-CSF)和2 532 bp(VP2+Akirin2+GM-CSF串联基因)，与预期结果一致(图2)。

M1.DNA 标准DL 2 000;1.VP2；2.Akirin2；3.GM-CSF；4.VP2-Akirin2-GM-CSF；M2.DNA标准 DL 5 000M1.DNA Marker DL 2 000;1.VP2；2.Akirin2；3.GM-CSF；4.VP2-Akirin2-GM-CSF；M2.DNA Marker DL 5 000图2 目的基因PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of objective genes

2.2 pT-VP2-Akirin2-GM-CSF重组质粒酶切鉴定结果

将重组质粒pTVP2-Akirin2-GM-CSF经SacⅠ/Hind Ⅲ双酶切鉴定，获得大小分别约为5 100 bp和2 500 bp的两个片段(图3)，与预期结果相符，测序结果也表明重组质粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF构建正确。

2.3 SDS-PAGE检测结果

pT-VP2-Akirin2-GM-CSF转染 293T细胞，于转染后48 h收集细胞裂解后，分别检测表达VP2、Akirin2和GM-CSF 3种蛋白的表达情况，证实pT-VP2-Akirin2-GM-CSF能在293T细胞中表达目标蛋白，检测结果见图4和图5。从图4可知，3种蛋白均有表达。

M.DNA 标准DL 15 000;1.pTriEx-4；2.pT-VP2-Akirin2-GM-CSFM.DNA Marker DL 15 000;1.pTriEx-4；2.pT-VP2-Akirin2-GM-CSF图3 重组质粒质粒SacⅠ/Hind Ⅲ双酶切鉴定结果Fig.3 Identification results of pT-VP2-Akirin2-GM-CSF digested with SacⅠ/Hind Ⅲ

2.4 间接免疫荧光检测结果

将pT-VP2-Akirin2-GM-CSF与适量Lipofectamine LTX充分混匀后，加入铺有293T细胞的细胞培养板中，采用IFA分别检测VP2、Akirin2、GM-CSF的表达情况，由图5可以看出3种基因都能在293T细胞中表达。

2.5 免疫攻毒保护试验

SPF鸡注射相应DNA后，直至攻毒前，其状态未见异常，说明该重组DNA对鸡体的正常生理活动无影响。在第14天对照试验组1和试验组4(pT-VP2-Akirin2-GM-CSF质粒注射组)血清中检测到特异性IBDV抗体和IBDV中和抗体，第28天抗体滴度明显升高，且试验组4的抗体滴度极显著高于试验组1(P<0.01)(表2和表3)。第28天该两组鸡外周血淋巴细胞增殖能力均增强，且极显著高于其余各对照试验组(P<0.01)，试验组4的外周血淋巴细胞增殖能力极显著高于对照试验组1(P<0.01)(表4)。于第28天进行攻毒试验，与其余各组相比，对照试验组1和试验组4的鸡只死亡数和法氏囊病变量均明显减少，试验组4的存活保护率达到100%，病变保护率达到85%，保护效果优于试验组1(存活保护率达到95%，病变保护率达到55%)(表5)。说明3基因共表达质粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF作为DNA疫苗免疫后能够诱导宿主产生体液免疫应答和细胞免疫应答，其诱导的应答水平明显高于单基因表达载体pT-VP2诱导的应答水平，其免疫鸡只抵抗IBDV BC6/85毒株感染的能力更强。

M.蛋白分子质量标准;1.pT-Akirin2转染293T细胞后表达产物；2.pT-GM-CSF转染293T细胞后表达产物；3.pT-VP2转染293T细胞后表达产物；4.pT-VP2-Akirin2-GM-CSF转染293T细胞后表达产物；5.正常293T细胞表达产物M.Protein molecular weight Marker;1.The expression products of 293T cells after transfection with pTAkirin2;2.The expression products of 293T cells after transfection with pTGM-CSF;3.The expression products of 293T cells after transfection with pTVP2;4.The expression products of 293T cells after transfection with pTVP2-Akirin2-GM-CSF;5.The expression products of 293T cells图4 目的蛋白的SDS-PAGE检测结果Fig.4 SDS-PAGE results of objective proteins

图5 重组质粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF转染293T细胞之后的间接免疫荧光试验检测结果Fig.5 Detection results of indirect immunofluorescence of 293T cells after transfection with pTVP2-Akirin2-GM-CSF

表2 试验鸡免疫后血清IBDV抗体水平检测结果Table 2 Detection results of IBDV antibody levels of chicken sera

注：**表示与试验组4差异极显著(P<0.01)。
Note:**means extremely significant difference compared with treatment group 4 (P<0.01).

表3 试验鸡免疫后血清IBDV中和抗体滴度参数(TITER)变化Table 3 Detection results of IBDV neutralizing antibody levels of chicken sera

注：**表示与试验组4差异极显著(P<0.01)。
Note:**means extremely significant difference compared with treatment group 4 (P<0.01).

表4 免疫后第28天试验鸡外周血淋巴细胞增殖能力检测结果Table 4 Proliferation activity of peripheral blood lymphocytes from checken blood on day 28 post-immunization

注：**表示与试验组4差异极显著(P<0.01)。
Note:**means extremely significant difference compared with treatment group 4 (P<0.01).

3 讨论

DNA疫苗是将编码某种抗原的基因克隆到真核表达载体上，直接注射到动物机体，通过宿主细胞的蛋白表达与加工系统合成抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。因此，构建IBDV DNA疫苗最重要的是选择合适的能诱导机体产生对IBDV产生免疫保护作用的靶基因。VP2是IBDV的主要结构和抗原蛋白，与病原的毒力变异和致病性有关，还可以诱导机体产生中和抗体，因此，本研究选择VP2基因作为IBDV DNA疫苗的靶基因。本试验采用的VP2基因序列来源于IBDV超强毒Gx株，将其插入真核表达载体，转染293T细胞，经间接免疫荧光检测，结果显示VP2基因得到了表达，这与刘红梅等[10]研究的结果一致，VP2能在真核表达载体上表达。另外，VP2作为潜在的免疫原来研究IBDV基因工程疫苗， 且已在大肠埃希菌系统、 酵母、 昆虫细胞、 禽痘病毒、 腺病毒、 火鸡疱疹病毒中得到成功表达。本研究选择Novagen公司设计的pTriEx-4质粒作为表达载体，该载体是一种多系统通用的表达载体，带有CMV、T7、p10三种启动子，可以进行哺乳动物细胞表达、原核表达和杆状病毒表达，本实验室也验证了该载体可以在原核表达和杆状病毒表达系统中表达。DNA疫苗的抗原合成和递呈过程与病原的自然感染极为相似，抗原蛋白经内源性途径转运到细胞表面，不仅可以诱导体液免疫，还可诱导细胞免疫[13]。本试验构建的pT-VP2单基因疫苗在注射后不仅可以诱导机体产生抗体和中和抗体，还能诱导外周淋巴细胞增殖，说明本研究构建的DNA疫苗不仅可以诱导体液免疫，也可诱导细胞免疫。

表5 免疫鸡攻毒后存活和病变情况Table 5 Survival and lesions in immunizaed chickens challenged with IBDV BC6-85 strain

注：*表示与试验组4差异显著(P<0.05)。
Note：*means significant difference compared with treatment group 4 (P<0.05).

为了探讨鸡Akirin2和GM-CSF对IBDV VP2 DNA疫苗免疫效果的影响，本试验根据GenBank上IBDV VP2(AF508177)、鸡源(Gallus)Akirin2(NM-001193595)和GM-CSF(EU939770.1)，设计并优化合成三者全序列并进行串联。为了不影响串联基因表达后各自的蛋白构象，采用连接肽F-2A作为连接元件。F-2A是一种小分子连接肽，在真核表达系统中剪切活性高(90%以上)，且不会影响到上、下游蛋白的生物活性。将三表达重组质粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF瞬时转染293T细胞，通过SDS-PAGE和Western blot分析，表明3种蛋白均能够在细胞中表达，且具有相应蛋白的免疫反应原性，说明F-2A不会影响VP2-Akirin2-GM-CSF串联基因的表达。

本研究将重组质粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF作为DNA疫苗免疫SPF鸡，并利用pT-Akirin2、pT-GM-CSF、pT-VP2、pT-VP2-Akirin2、pT-VP2-GM-CSF、空载体作为对照，加强免疫后经口感染IBDV BC6-85，对存活保护率、BBIX和病变保护率进行了统计学分析。我们发现，VP2 DNA疫苗可以提供55%的病变保护率，并将死亡率减小至0， Akirin2和GM-CSF共同作为免疫增强剂后病变保护率明显改善，提高至85%。pT-VP2-Akirin2-GM-CSF质粒注射组在一免后第14天可以检测特异性IBDV抗体和IBDV中和抗体，第28天后抗体滴度明显提高，说明两种细胞因子有免疫增强作用。通过ConA刺激重组质粒免疫二免后14 d外周血淋巴细胞的增殖能力，表明pVP2-Akirin2-GM-CSF诱导的淋巴细胞增殖能力显著高于其余各重组质粒。说明Akirin2和GM-CSF在VP2基因诱导的T细胞增殖和辅助性T细胞(Th细胞)分化过程中起到明显的促进作用。GM-CSF可能是通过促进包括树突状细胞( DC)在内的抗原递呈细胞(APC) 的增殖分化, 并将其吸引到注射部位, 增强抗原递呈能力, 从而达到增强免疫效果的作用[14]，Akirin2可能通过Toll-样 受体( toll-like receptor，TLR) 、 肿瘤坏死因子( TNF) 和白介素-1β( IL-1β) 信号通路发挥功能[11]。Akirin2和GM-CSF都是具有很好发展前景的免疫增强剂，其具体作用机制有待进一步研究。

[1] 卡尔尼克.禽病学[M].10版.高 福, 苏敬良,译.北京:中国农业出版社,1999:914-937.

[2] Brown M D,Green P,Skinner M A.VP2 sequences of recent European 'very virulent' isolates of infectious bursal disease virus are closely related to each other but are distinct from those of 'classical' strains[J].J Gen Virol，1994,75(Pt3):675-680.

[3] Mardassi H,Khabouchi N,Ghram A,et al.A very virulent genotype of infectious bursal disease virus predominantly associated with recurrent infectious bursal disease outbreaks in Tunisian vaccinated flocks[J].Avian Dis,2004,48(4):829-840.

[4] Yamaguchi T,Kasanga C J,Terasaki K,et al.Nucleotide sequence analysis of VP2 hypervariable domain of infectious bursal disease virus detected in Japan from 1993 to 2004[J].J Vet Med Sci, 2007,69(7):733-738.

[5] Davis H L,Michel M L,Mancini M,et al.Direct gene transfer in skeletal muscle: plasmid DNA-based immunization against the hepatitis B virus surface antigen[J].Vaccine,1994,12(16):1503-1509.

[6] Krishnan B R.Current status of DNA vaccines in veterinary medicine[J].Adv Drug Delivery Rev,2000,43(1):3-11.

[7] Oppling V,Muller H,Becht H.Heterogeneity of the antigenic site responsible for the induction of neutralizing antibodies in infectious bursal disease virus[J].Arch Virol,1991,119(3-4):211-223.

[8] Eterradossi N,Arnauld C,Toquin D,et al.Critical amino acid changes in VP2 variable domain are associated with typical and atypical antigenicity in very virulent infectious bursal disease viruses[J].Arch Virol,1998,143(8):1627-1636.

[9] Fernandez-Arias A,Martinez S,Rodriguez J F.The major antigenic protein of infectious bursal disease virus,VP2,is an apoptotic inducer[J].J Virol,1997,71:8014-8018.

[10] 刘红梅，秦爱建，许小琴,等.传染性法氏囊病病毒JS 株VP2基因真核表达载体的构建及其应用[J].中国预防兽医学报， 2006， 28(4)：461-465.

[11] Goto A,Matsushita K,Gesellchen V,et al.Akirins are highly conserved nuclear proteins required for NF-kappaB-dependent gene expression in drosophila and mice[J].Nat Immunol,2008,9(1):97-104.

[12] 徐志坤，薄联峰，温俊歌,等.猪 Akirin2基因的定位及其影响IL-1β和IL-6mRNA表达的研究[J].中国兽医杂志，2011,47(11):25-27.

[13] Disis M L,Bernhard H,Shiota F M,et al.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines[J].Blood,1996;88(1):202-210.

[14] 卿玉玲.GM -CSF.增强DNA疫苗免疫效果的研究进展[J].国外医学:免疫学分册，2003，26(6)：321-323.

Akirin2andGM-CSFPromotetheImmuneEffectofVP2DNAVaccineagainstInfectiousBursalDiseaseVirus

REN Guang-cai1，LIU Chuan-gao2，HUANG Miao-rong1，HUAN Wen-ke1， ZHONG Chu-hong2，LIU Yu-fu2，CHEN Rui-ai1,2

(1.ZhaoqingDahuanongBiologyMedicineCo.,Ltd,Zhaoqing,Guangdong,526238,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

To enhance the immunogenicity of the VP2 DNA vaccine of infectious bursal disease (IBD),the synthesized IBDV VP2,chicken Akirin2 and GM-CSF genes were tandemly cloned into eukaryotic expression vector pTriEx-4 to obtain the recombinant plasmid pT-VP2-Akirin2-GM-CSF.Then the plasmid was used to transfect into 293T cells and analyzed by SDS-PAGE.As expected,the three calculated proteins were approximately 58 ku,35 ku and 22ku.Then,the SPF chickens were immunized with pT-VP2-Akirin2-GM-CSF,followed by challenging with IBDV BC6-85 at 2 weeks post the boost vaccination and the protective rate was calculated 4 days later.The result showed that specific antibodies of IBDV and IBDV neutralizing antibody were detected in sera of the group immunized with pT-VP2-Akirin2-GM-CSF after 14 days,and the antibody titers were extremely higher than that tested in control group after 28 days(P<0.01).Moreover,the result of proliferation of peripheral blood lymphocytes also showed that the ability of proliferation in the group immunized with pT-VP2-Akirin2-GM-CSF was significant stronger than that in control group(P<0.01).

Infectious bursal disease;vp2 protein;chicken Akirin2；chicken GM-CSF；DNA vaccine

2017-02-20

广东省应用型科技研发专项资金项目(2015B020230011)

任广彩(1982-)，女，山东人，博士，主要从事基因工程疫苗研究。*

S852.659.4;S852.43

A

1007-5038(2017)10-0013-08