芦蒿叶中黄酮类化合物的纯化及其营养饼干的研制

卢永翎 - 王 晨 梁玉理 - 朱 坤 朱潇仪 - 郭红梅 - 吕丽爽 -

(南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097) (Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210097, China)

芦蒿叶中黄酮类化合物的纯化及其营养饼干的研制

卢永翎LUYong-ling王 晨WANGChen梁玉理LIANGYu-li朱 坤ZHUKun朱潇仪ZHUXiao-yi郭红梅GUOHong-mei吕丽爽LULi-shuang

(南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097) (GinlingCollege,NanjingNormalUniversity,Nanjing,Jiangsu210097,China)

以吸附率和解吸附率为评价指标，从16种树脂里筛选出富集芦蒿叶中黄酮类化合物效果最佳的NKA-2型树脂，进而选择NKA-2型树脂柱对不同浓度乙醇的解吸液进行考察。结果表明，20%乙醇洗脱组分中黄酮类化合物得率和纯度最高，分别为38.56%和67.80%。将该组分芦蒿叶提取物加入面粉中制备出芦蒿营养饼干，通过探讨饼干配方及生产工艺确定2种不同口味饼干的最佳配方。

大孔吸附树脂；芦蒿；黄酮类化合物；饼干

芦蒿(ArtemisiaselengensisTurcz)为菊科蒿属多年生草本植物，学名萎蒿，又名狭叶艾、白蒿等。芦蒿风味独特，味道鲜美，《本草纲目》[1]中记为“主治五脏邪气，风寒湿脾，补中气，利膈开胃，可去东河豚毒”。芦蒿中富含氨基酸、维生素、微量元素[2-3]及黄酮类化合物[4-6]，是典型的保健蔬菜。黄酮类物质具有抗氧化[7-8]、清除体内自由基[9]、降血糖[10]、降血脂[11]、抗肿瘤[12]等多种功能。南京八卦洲芦蒿种植面积超过1 300 hm2，产量4万t，产值近1.6亿元，但是人们主要食用芦蒿的嫩茎，对于含有更多黄酮类化合物的芦蒿叶缺乏进一步的开发利用，造成一定的浪费。

涂宗财等[5]和付庆权等[6]采用响应面法优化了芦蒿叶中总黄酮的提取工艺，但有关芦蒿叶黄酮的富集和纯化，特别是其在大孔树脂上的吸附动力学研究尚未见报道。大孔吸附树脂分离技术对黄酮类化合物的筛分有着广泛应用[13-16]，树脂的吸附性能与其极性、空间结构有重要关系。本试验以芦蒿叶为原料，研究了HPD417、NKA-2、HPD950、AB-8等16种大孔树脂对芦蒿叶黄酮的吸附与解吸附性能，以期寻找对芦蒿叶总黄酮精制纯化的有效方法，并将其与易于进行营养强化处理的饼干相结合，通过优化产品配方研制出风味独特的芦蒿饼干，为芦蒿叶的开发利用以及健康食品的拓展提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

芦蒿：南京八卦洲野生蔬菜基地；

芦丁标准品：含量98%，上海源叶生物科技有限公司；

无水乙醇：分析纯，南京宁试化学试剂有限公司；

氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、乙酸乙酯、甲醇、硫酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

HPD100、HPD417、HPD450、HPD600、HPD722、HPD950、ADS17、DM130、APD500、APD750、D101树脂：河北沧州宝恩生化制剂厂；

NKA-2、NKA-9、AB-8、X-5、聚酰胺树脂：天津南开大学化工厂；

低筋粉、优级白砂糖、小苏打、食盐、奶香粉、抹茶粉、可可粉：市售。

1.1.2 仪器

紫外-可见分光光度计：UV-6100A型，上海元析仪器有限公司；

冷冻干燥机：FreeZone 2.5 Plus型，美国Labconco公司；

质构仪：QTS-25型，美国Brookfield CNSFarnell公司；

分析天平：AUY220型，日本岛津公司；

高速万能粉碎机：FM177型，天津泰斯特仪器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9140型，上海精宏试验设备有限公司；

旋转蒸发器：RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂；

电烤炉：YXD101-2型，早苗食品机械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芦蒿叶黄酮的提取及测定

(1) 芦蒿叶粗提液的制备： 新鲜芦蒿洗净、去除老、黄叶子后烘干，粉碎，按料液比1∶50 (g/mL)加入75%乙醇溶液，90 ℃加热回流90 min，冷却，抽滤。残渣重复提取1次。合并两次提取液旋转蒸发，冷冻干燥，得芦蒿叶总黄酮粗提物[5-6]。

(2) 黄酮类化合物标准曲线的建立：参考文献[6]，以芦丁为对照，采用Al(NO3)3显色法，在波长510 nm处测定，以不同浓度的芦丁为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 大孔树脂纯化芦蒿叶粗提物

(1) 大孔树脂的预处理：取16种树脂适量，蒸馏水洗去杂质及破碎树脂，于70 ℃干燥至质量恒定，备用。分别精密称取1.0 g于250 mL锥形瓶中，95%乙醇浸泡24 h后，用蒸馏水洗至无醇味。

(2) 大孔吸附树脂对黄酮类化合物的静态吸附和解吸附：将预处理好的大孔树脂置于250 mL锥形瓶内，加入50 mL 芦蒿叶总黄酮粗提物的稀释样液(0. 536 mg/mL)，振荡吸附24 h(25 ℃，150 r/min)，测定吸附平衡后样液中黄酮类化合物的浓度；用蒸馏水冲洗树脂中残余黄酮类化合物后吸干水分，加入70%乙醇振荡解吸附24 h(25 ℃，150 r/min)，过滤，测定滤液中黄酮类化合物的浓度，并按式(1)～(4)计算树脂的吸附量、吸附率、解吸附率和回收率。

(1)

(2)

(3)

R=A×D×100%，

(4)

式中：

Qa——干树脂的吸附量，mg/g；

A——吸附率，%；

D——解吸率，%；

R——回收率，%；

C0——吸附液起始浓度，mg/mL；

Cr——吸附后溶液浓度，mg/mL；

Cd——解吸液浓度，mg/mL；

Va——吸附液体积，mL；

W——树脂(干)重量，g；

Vd——解吸液体积，mL。

(3) 大孔树脂层析柱分离芦蒿叶提取物：参考文献[13～15]方法，取经预处理的NKA-2树脂100 mL湿法装柱(Ф 4.0 cm×30 cm)，一定浓度的芦蒿叶粗提液上样，先用水洗脱3 BV，再依次用不同体积分数的乙醇解吸液(20%，40%，60%，80%)以1.5 BV/h的流速进行洗脱，收集流出液并用薄层色谱板检测(展开剂为20∶15∶2∶1的甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸∶水，显色剂为10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热下检视)，合并，减压浓缩并冷冻干燥保存，测定各洗脱组分中黄酮的含量。

1.2.3 芦蒿饼干的制作

(1) 基本配方及工艺流程：低筋粉100%(以面粉为基准，其他辅料以占面粉质量比例计算)、鸡蛋(全蛋)90%、蛋黄10%、白砂糖40%、小苏打1%、食盐0.9%、奶香粉0.9%、水适量。

原辅料挑选→称量→原辅料预混、打发→加入20%乙醇洗脱得到的芦蒿叶提取物、面粉、小苏打、奶香粉进行调粉(可添加可可粉或抹茶粉)→成型→烘烤(上火温度控制为200 ℃，底火温度控制为180 ℃，时间约为15 min)→冷却→检验→成品

(2) 饼干中黄酮含量的测定：将饼干样用粉碎机粉粹，加入70%乙醇水溶液磁力搅拌1 h，过滤膜取续滤液按1.2.1项下芦丁标准曲线制备方法配置溶液并测定吸光度值。

(3) 影响饼干感官品质的因素分析：通过探讨芦蒿叶提取物用量、白砂糖用量、可可粉和抹茶粉加入量对饼干品质的影响，以感官评定为标准，确定芦蒿饼干的最佳配方。芦蒿叶提取物用量对饼干质量的影响：面粉用量183 g，分别添加550，800，1 050，1 300 μg/g的黄酮类化合物，其他辅料用量与基本配方相同。白砂糖用量对饼干品质的影响：面粉用量183 g，黄酮类化合物添加量800 μg/g，白砂糖添加量分别为55，73，91，110 g。可可粉用量对饼干品质的影响：面粉用量为183 g，黄酮类化合物的添加量为800 μg/g，白砂糖添加量为73 g，分别加入可可粉18.3，27.5，36.6 g。抹茶粉用量对饼干品质的影响：面粉用量183 g，黄酮类化合物添加量800 μg/g，白砂糖添加量73 g，分别加入抹茶粉3.7，9.2，14.7 g。

(4) 模糊评判方法：参考文献[17～19]方法，由10位食品专业人员组成评定小组，从饼干色泽、形状、结构、风味和口感5个方面评定产品品质，评定标准见表1。

(5) 饼干质构分析：用QTS-25型质构仪对饼干硬度、内聚性、弹性、咀嚼性进行测定分析，评价饼干的品质。测定条件：压缩模式，选用TA5探头，压缩距离1.5 mm，等待时间3 s，触发力5 g，测试前速度1.0 mm/s，测试速度0.5 mm/s，测试后速度0.5 mm/s。

2 结果与分析

2.1 芦蒿中黄酮类化合物的提取优化

2.1.1 黄酮类化合物标准曲线的建立 标准曲线方程为：y=0.09x+0.000 2，R2=0.999 9，根据回归方程计算芦蒿叶及饼干中黄酮类化合物的含量。

表1 芦蒿饼干感官评分标准Table 1 Sensory estimate standard of healthy biscuits with flavonoids

2.1.2 树脂吸附及解吸附能力的比较 16种树脂对芦蒿中黄酮类化合物的静态吸附及解吸附结果见表2。经Spss 17.0 数据处理软件进行显著性分析，表明各树脂对黄酮类化合物的吸附率和解吸附率均存在显著性差异(P<0.05)。大孔树脂是一种高分子聚合物，具有吸附性和筛选性相结合的特点，可以根据吸附力(范德华力或氢键吸附)和分子量的大小选择性地吸附有机物[20]。由表2可知，吸附能力较好的树脂有HPD417、NKA-2、HPD950、AB-8，其中NKA-2型树脂对芦蒿叶中黄酮类化合物的解吸附率和回收率分别达到88.89%和74.42%，优于其他3种树脂。综合考虑，NKA-2型树脂适用于芦蒿叶中黄酮的纯化。

2.1.3 解吸剂浓度对黄酮洗脱效果的影响 考虑到提取的黄酮类物质用于添加到食品中，本试验采用乙醇作为解吸剂。由表3可知，20%乙醇洗脱得率与效果最佳，得率达到38.56%，纯度达到67.80%。经Spss 17.0显著性分析表明：各浓度乙醇洗脱组分中黄酮的得率与纯度均具有显著性差异(P<0.05)。由此可见以NKA-2型树脂柱分离时，可用20%乙醇来纯化黄酮类化合物。

2.2 饼干制作工艺优化

2.2.1 芦蒿饼干中黄酮类化合物的含量 将未加芦蒿叶提取物的饼干与加入F1的饼干分别按1.2.3的方法进行黄酮类化合物的提取和含量测定，由表4可知，加入芦蒿提取物后，每克饼干中的黄酮类化合物含量可以提高200 μg左右，效果比较显著。

2.2.2 辅料添加量对产品质量的影响 由表5可知，芦蒿叶中黄酮纯化物F1的添加量对产品结构与形状几乎无影响，但在>1 050 μg/g时，饼干出现不愉悦的苦味；而添加量<800 μg/g时，则无黄酮类物质特有的风味。经过对比，当添加量为800 μg/g时，饼干具有较好的风味和口感。在色泽上，当添加量>1 050 μg/g时，较多的黄酮被氧化呈现黄色，影响饼干色泽；而当添加量<800 μg/g时，不显绿色。因此确定黄酮类化合物的最佳添加量为800 μg/g。

表2大孔树脂对芦蒿叶中黄酮类化合物静态吸附性能比较

Table 2 Comparison on static adsorption and desorption capabilities of different types of macro-porous resins (n=3) %

表3 乙醇浓度对黄酮类物质洗脱效果的影响Table 3 The effect of ethanol concentration on desorption performance (n=3) %

白砂糖添加量对饼干色泽、风味及口感有重要的影响。当白砂糖低于73 g时，饼干口感较硬且粘牙；添加量为73 g

表4芦蒿提取物对产品中黄酮类化合物含量的影响

Table 4 Effects ofArtemisiaSelengensisExtract on content of flavonoids in products (n=3)

产品不加芦蒿提取物黄酮类化合物含量/(mg·g-1)RSD/%加入芦蒿提取物黄酮类化合物含量/(mg·g-1)RSD/%原味饼干 0.8311.471.0792.75巧克力饼干1.7912.242.0030.71抹茶饼干 2.2442.722.4252.23

表5 辅料添加量对产品质量的影响Table 5 Effects of the amount of materials on product quality

时，焦糖化反应轻微，能够很好地体现芦蒿的淡绿色，并且口感酥松，味道纯正；添加量>91 g时，焦糖化反应明显，焙烤的金黄色与芦蒿提取物的绿色，形成了棕黄色甚至深褐色，影响产品品质。因此确定最佳白砂糖添加量为73 g。

可可粉的添加量对饼干的风味与结构有较大影响，而对色泽影响较小。当可可粉为27.5 g时，饼干具有疏松质地，同时在风味和色泽上的评分都较高。而抹茶粉对饼干的色泽、风味和结构均有较明显的影响，综合三者的结果，发现当抹茶粉添加量为9.2 g时，饼干的整体评分较高。因此确定最佳可可粉和抹茶粉添加量分别为27.5 g和9.2 g。

2.2.3 饼干产品的质构特性 为验证产品的质量(按2.2.2中最佳配方制作)，分别对添加黄酮纯化物F1的原味饼干、巧克力味饼干及抹茶味饼干进行了质构分析。由表6可知，3种饼干的硬度均在4 000 g左右，硬度适中，内聚性、弹性、咀嚼性均无显著性差异，内部疏松程度较好。

表6 3种饼干的质构特性分析Table 6 Texture properties of three kinds of biscuits (n=10)

3 结论

从16种大孔树脂中筛选出NKA-2型树脂对芦蒿叶黄酮粗提物进行精制纯化，其有良好的吸附和解吸附性能。当以3 BV水冲洗后，再用3 BV、20%乙醇以1.5 BV/h的流速进行洗脱，所得组分F1中黄酮类化合物有较好的得率和纯度，分别为38.56%和67.80%。当F1添加量为800 μg/g，糖占比40%时，饼干具有芦蒿独特的风味、口感酥脆。通过进一步优化可可粉(15%)和抹茶粉(5%)的添加量，确定2种不同口味的饼干配方。芦蒿饼干的营养价值高于普通饼干，是一种很好的日常健康食品，同时也为芦蒿叶的开发利用提供了一定的参考。

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PurificationofflavonoidsfromArtemisiaselengensisleavesandprepareationbakehealthybiscuitswiththeflavonoids

Flavonoids fromArtemisiaselengensisleaves were enriched by macro-porous resin NKA-2 that was chosen by comparing the static adsorption and desorption properties among 16 kinds of resins. As a result, the peak yield and purity of flavonoids can reach 38.56% and 67.80% respectively, when using 20% ethanol as eluent.Those natural extractions gained fromArtemisiaselengensisleaves were added into flour to produce a kind of healthy biscuits, and this study would further determine the optimal formula of those healthy biscuits with two different flavors by exploring biscuit recipes and producing processes.

macro-porous resin;Artemisiaselengensis; flavonoids; biscuit

国家自然科学基金资助项目(编号：31571783)

卢永翎，女，南京师范大学实验师，硕士。

吕丽爽(1969—)，女，南京师范大学教授，博士。

E-mail: lishuanglv@126.com

2017—06—09

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.037