术后疼痛对大鼠认知功能障碍的影响及其机制

任建光，吴雅娟，王文军

(儋州市人民医院，海南儋州571799)

术后疼痛对大鼠认知功能障碍的影响及其机制

任建光，吴雅娟，王文军

(儋州市人民医院，海南儋州571799)

目的探讨术后疼痛对大鼠认知功能障碍的影响及其机制。方法选择SD大鼠80只，采用随机数字表法分为模型组、对照组，每组40只。模型组右后足按Brennan法制作趾部切口疼痛模型，对照组仅麻醉，趾部不制作疼痛模型。模型组术后1(t1)、3(t2)、7(t3)、14天(t4)，对照组同时间，各随机取10只，分别检测右后足机械缩足阈值(MWT)、热缩足潜伏期(TWL)，通过Morris水迷宫实验检测穿越平台次数、平台停留时间。检测完上述指标，断头处死，取海马区脑组织，采用Western blotting法检测突触后膜致密蛋白95(PSD95)、N- 甲基- D- 天冬氨酸受体2B亚型(NR2B)表达。结果模型组t1～t4MWT、TWL均低于对照组同期，穿越平台次数、平台停留时间均低于对照组同期，海马区PSD95、NR2B相对表达量均低于对照组同期(P均<0.05)。结论术后疼痛可导致大鼠认知功能障碍发生,其机制可能与疼痛刺激使海马区PSD95、NR2B表达降低有关。

认知功能障碍；疼痛；海马区；突触后膜致密蛋白95；N- 甲基- D- 天冬氨酸受体2B亚型；大鼠

术后认知功能障碍是患者全麻术后出现的一种中枢神经系统并发症，多发生于老年人[1]。其发病机制至今仍不十分清楚。研究发现，人脑组织海马区存在N- 甲基- D- 天冬氨酸(NMDA)受体，该受体可调节海马神经元发育和突触形成，在学习、记忆和认知过程中具有重要作用[2，3]。突触后膜致密蛋白95(PSD95)可结合NMDA受体2B亚型(NR2B)形成突触后膜蛋白复合物，在海马回的突触重塑过程中发挥重要作用[4]。2016年9月～2017年2月，本研究观察术后疼痛对大鼠认知功能障碍的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠80只，SPF级，18月龄，体质量(400±30)g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2016- 0002。所有大鼠单笼饲养，自由摄食饮水，室温22～25 ℃，湿度55%～65%，12 h昼夜交替。Morris水迷宫系统，上海欣软信息科技有限公司；电泳仪、转膜仪，北京六一仪器厂；PL- 200热刺痛仪，成都泰盟科技有限公司；Von Frey电子测痛仪，北京中昊万通科技有限公司；酶标仪，上海一恒科技有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京碧云天生物科技有限公司；鼠抗PSD95、兔抗NR2B一抗，美国Sigma公司；鼠抗β- actin一抗、HRP标记的山羊抗鼠及山羊抗兔二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物分组及模型制备 所有大鼠适应性喂养1周，采用随机数字表法分为模型组、对照组，每组40只。模型组右后足按Brennan法制作趾部切口疼痛模型。具体步骤：大鼠采用20%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，右后肢备皮，安尔碘消毒，铺无菌洞巾，用15号刀片从足跟近端0.5 cm处向趾部作一长约1.0 cm的纵向切口，尽量避开血管以减少出血，逐层切开皮肤，分离筋膜和肌肉，用镊子挑起足底肌肉，纵向切开，纱布按压减少出血，用0号丝线缝合肌肉和皮肤，建模完成。整个手术过程不超过5 min。对照组同法麻醉，趾部不制作疼痛模型。两组均于温暖环境中自然苏醒，避免强光和噪音刺激。

1.3 相关指标观察

1.3.1 机械缩足阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL) 模型组术后1、3、7、14天(分别记为t1、t2、t3、t4)，对照组同时间，各随机取10只，检测右后足MWT和TWL。所有大鼠置于Von Frey电子测痛仪或PL- 200热刺痛仪上适应20 min，并排除光线、噪音、环境等干扰因素。MWT检测：待大鼠安静后，用Von Frey电子测痛仪的刺激针头从筛网下方垂直刺激术侧后爪中部，逐渐增加刺激强度，最大不超过40 g。大鼠出现逃避性抬足时的数值即为MWT。TWL检测：将PL- 200热刺痛仪置于大鼠术侧足底中部，用红外光近距离照射足底，照射时间最长15 s。从照射开始到大鼠出现逃避性抬腿的时间即为TWL。检测时间为9：00～12：00。每只大鼠重复检测5次，每次刺激间隔5 min，取其平均值。

1.3.2 穿越平台次数及平台停留时间 采用Morris水迷宫实验。Morris水迷宫泳池分为四个象限，平台位于其中一个象限中央。两组均于术前进行为期5天的获得性训练。将大鼠头朝向池壁轻轻放入水中，记录大鼠水下找到平台的时间，并让其在平台上停留30 s；若60 s内未能找到平台，引导其上平台并在平台停留30 s。每天训练4次，每次间隔大于30 min。两组检测完MWT、TWL后进行探查训练。撤除Morris水迷宫平台，将大鼠从原入水点的对侧放入水中，并通过摄像系统记录60 s内大鼠游过目标象限(原平台所在象限)的次数(即穿越平台次数)及时间(平台所在象限停留时间)。

1.3.3 海马区PSD95、NR2B表达 采用Western blotting法。各组完成Morris水迷宫实验后，20%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，断头处死，迅速剥离枕骨和顶骨，完整取海马区脑组织，- 80 ℃冰箱保存。所有脑组织收集完毕后置于蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂中，电动匀浆，室温裂解30 min，4 ℃、13 000×g离心20 min，取上清液，BCA法进行蛋白定量后，加入5×上样缓冲液，旋涡混匀，沸水浴变性10 min。取上样蛋白20 μg，行SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，当目的蛋白跑至凝胶底部时停止电泳，并转印至PVDF膜；封闭液封闭，然后分别加入鼠抗PSD95(1∶500)、兔抗NR2B(1∶500)、鼠抗β- actin(1∶2 000)一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜10 min×3次，加入 HRP标记的山羊抗鼠(1∶2 000)或山羊抗兔(1∶2 000)二抗，37 ℃孵育1 h；TBST洗膜10 min×3次，ECL发光，暗室显影、定影，Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以β- actin内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与β- actin蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组MWT、TWL比较 见表1。

2.2 两组穿越平台次数、平台停留时间比较 见表2。

2.3 两组海马区PSD95、NR2B表达比较 见表3。

3 讨论

表1 两组各时点MWT、TWL比较

注：与对照组同期比较，*P<0.05；与同组t1时比较，#P<0.05；与同组t2时比较，△P<0.05；与同组t3时比较，▲P<0.05。

表2 两组各时点穿越平台次数、平台停留时间比较

注：与对照组同期比较，*P<0.05；与同组t1时比较，#P<0.05；与同组t2时比较，△P<0.05。

表3 两组各时点海马区PSD95、NR2B 相对表达量比较

注：与对照组同期比较，*P<0.05；与同组t1时比较，#P<0.05；与同组t2时比较，△P<0.05；与同组t3时比较，▲P<0.05。

POCD是全麻术后出现的中枢神经系统并发症，主要表现为精神错乱、焦虑、人格改变以及记忆受损等，是老年人术后常见的并发症之一，可导致患者生活质量下降、住院时间延长、医疗成本增加、病死亡率升高等[5]。随着我国人口老龄化加剧，老年人因各种疾病入院接受全麻手术者逐渐增多，POCD的发生率亦逐渐升高。目前，对POCD产生的原因主要考虑麻醉药物、患者年龄等因素，而对手术本身疼痛刺激的研究较少。

术后持续性疼痛是临床上常见的一种病理性疼痛，一般认为是由伤害感受器持续性兴奋而引发的中枢敏感化而致。研究发现，手术相关的伤害性刺激可促进POCD的发生，伤害性刺激后的痛觉过敏也与POCD密切相关[6，7]。本研究模型组按Brennan法制作大鼠趾部切口疼痛模型，对照组仅麻醉，不作趾部切口疼痛模型，观察两组疼痛敏感性变化；结果发现，模型组术后1～14天MWT、TWL均明显降低，表明趾部切口手术可诱发术后痛觉过敏现象。本研究通过Morris水迷宫实验评价小鼠学习记忆能力，结果发现，在伤害性刺激存续期间，模型组穿越平台次数较对照组明显减少，平台停留时间较对照组明显缩短，说明模型组已经出现了认知功能障碍，且可能与手术伤害性刺激有关。

NMDA受体广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统中，并与突触可塑性及神经兴奋性毒性密切相关。NMDA受体分为NR1、NR2和NR3三种亚单位，其中NR2亚单位中的NR2B亚基在中枢痛敏的形成和神经系统的学习记忆突触机制中至关重要[8，9]。手术相关的伤害性刺激能阻断NMDA受体，抑制突触前膜谷氨酸的释放，使大脑神经元发生退行性病变[10]。NR2B亚基在脊髓以上大脑皮层密度最高。有研究表明，存在认知功能障碍的动物可出现与认知相关的脑区皮层重排[11]，如内侧前额叶、前扣带回和海马区等，这可能是出现认知功能障碍的基础。海马作为情绪、学习和记忆中枢，在工作记忆、情感记忆及注意力调节等脑功能中发挥重要作用[12]。有研究发现，疼痛模型大鼠的认知功能减退与海马-前额叶皮层的通路结构连接减少有关。Qiu等[13]研究发现，海马区NMDA受体NR2B亚基有助于海马神经元发育和突触形成。PSD95是一种突触后膜标记物，可代表突触的形态和密度。有研究发现，PSD95表达降低与突触数量减少或突触丢失以及学习和记忆功能损害有关[14]。NMDA受体活性受PSD95蛋白家族调节，PSD95本身没有蛋白酶活性，但可结合NMDA受体亚基NR2B，形成PSD95/NR2B复合物，参与NMDA受体介导的突触信号传递和突触可塑性调节等[15]。阚红军等[16]研究发现，神经病理性疼痛可引起依赖于NMDA受体的PSD95重新分布，而大鼠出现空间记忆障碍与内侧前额叶部位突触小体PSD95的重塑有关。本研究模型组海马区各时间点PSD95、NR2B相对表达量均低于对照组，说明术后疼痛刺激能够抑制海马区突触重塑，且可阻断NMDA受体，抑制突触前膜谷氨酸释放，增加神经兴奋性毒性，与上述观点基本一致。

综上所述，术后疼痛可致大鼠认知功能障碍发生，其机制可能与疼痛刺激使海马区PSD95、NR2B表达降低有关。本研究为海马区PSD95、NR2B有可能作为术后认知功能障碍的治疗靶点提供了理论基础。

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10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.013

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