改良三甲散灌胃对老年性痴呆大鼠记忆能力及海马组织Aβ、NGF表达的影响

冯丽谦，杨丽丽，高海婷，薛康丽，刘涛

(南京中医药大学，南京210023)

改良三甲散灌胃对老年性痴呆大鼠记忆能力及海马组织Aβ、NGF表达的影响

冯丽谦，杨丽丽，高海婷，薛康丽，刘涛

(南京中医药大学，南京210023)

目的探讨改良三甲散灌胃对老年性痴呆大鼠记忆能力及海马组织β- 淀粉样前体蛋白(Aβ)、神经生长因子(NGF)的影响。方法选择SD大鼠72只，随机分为假手术组、模型组、多奈哌齐组及三甲散高、中、低剂量组，每组12只。除假手术组外，其余各组建立老年性痴呆大鼠模型。多奈哌齐组建模后第1天开始予盐酸多奈哌齐溶液0.21 mg/(mL·kg)灌胃，三甲散低、中、高剂量组建模后第1天开始分别予改良三甲散溶液1.25、2.5、5 g/(mL·kg)灌胃，模型组、假手术组同期予等体积生理盐水灌胃，各组均连续灌胃15天。各组于灌胃第3、7、15天行跳台实验和水迷宫实验，分别记录潜伏时间及逃避潜伏时间。各组末次水迷宫实验后，颈椎脱臼法处死，取海马组织，制备组织切片，采用免疫组化法检测海马组织Aβ、NGF表达。结果灌胃第3、7、15天，模型组潜伏时间及逃避潜伏时间均长于假手术组(P均<0.05)。灌胃第7天，多奈哌齐组及三甲散高剂量组潜伏时间均短于模型组，三甲散高剂量组逃避潜伏时间短于模型组及三甲散低剂量组(P均<0.05)。灌胃第15天，多奈哌齐组及三甲散高、中、低剂量组潜伏时间均短于模型组，多奈哌齐组及三甲散高、中剂量组逃避潜伏时间均短于模型组，且三甲散高剂量组逃避潜伏时间缩短更明显(P均<0.05)。模型组海马组织Aβ表达高于假手术组，NGF表达低于假手术组(P均<0.05)。多奈哌齐组与三甲散中剂量组海马组织Aβ表达均低于模型组及三甲散高、低剂量组，海马组织NGF表达均高于模型组(P均<0.05)。结论改良三甲散灌胃可提高老年性痴呆大鼠的记忆能力，并具有剂量依赖性；其作用机制可能与降低海马组织Aβ表达、提高NGF表达有关。

老年性痴呆；改良三甲散；中药；β- 淀粉样前体蛋白；神经生长因子；大鼠

老年性痴呆是一种以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格、行为改变等为主要临床表现的神经退化性疾病，其特征性病理改变是颞叶和海马皮质等部位老年斑形成、神经元纤维缠结和神经元丢失[1，2]。改良三甲散是在《温疫论》名方“三甲散”的基础上加减优化而成的，方剂由龟板、鳖甲、首乌等药物组成，具有滋阴潜阳、填精益髓、活血化瘀、祛痰化浊、搜络开窍作用[3]。有研究证实，改良三甲散能改善老年性痴呆患者的记忆能力[4]。但目前对其作用机制尚不完全清楚。2016年3～10月，本研究观察了改良三甲散对老年性痴呆大鼠记忆能力及海马组织β- 淀粉样前体蛋白(Aβ)、神经生长因子(NGF)表达的影响。现分析结果并报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠72只，SPF级，雌雄各半，体质量(220±20)g，由南京中医药大学实验动物中心提供。改良三甲散溶液，含生药量1 g/mL，本院自制(龟甲、鳖甲、何首乌、石菖蒲各20 g，地鳖虫、地龙各10 g，捣碎后加10倍纯净水煎煮0.5 h，过滤保存药液；药渣中加8倍纯净水煎煮0.5 h，过滤保存药液；将两次保存的药液合并，浓缩至100 mL，4 ℃保存备用)。盐酸多奈哌齐，江苏豪森药业股份有限公司；实验前碾碎，生理盐水溶解，制成浓度为0.04 mg/mL的盐酸多奈哌齐溶液。β淀粉样蛋白1- 42片断(Aβ1- 42)、鹅膏蕈酸(Ibo)、硫磺素- T，美国Sigma公司；APP免疫组化试剂盒、NGF免疫组化试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 动物分组处理 所有大鼠适应性喂养1周，随机分为假手术组、模型组、多奈哌齐组及三甲散低、中、高剂量组，每组12只。除假手术组外，其余各组参照刘涛等[5]的方法建立老年性痴呆大鼠模型。具体方法：大鼠腹腔注射D- 半乳糖50 mg/(kg·d)，连续30天；第31天腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后固定于脑立体定位仪上，沿颅骨正中线切开皮肤，暴露硬脑膜；根据大鼠脑立体定位图谱[6]双侧定位，以前脑基底核水平为标准位，前囟中心为零点，前囟后3.3 mm、双侧旁开1.5 mm、深3.3 mm，微量进样器自脑表面垂直进针，注射Aβ1- 42与Ibo的混合液2 μL(内含Aβ1- 42 5 μg、Ibo 5 μg)，分4次注射，20 min内注射完毕。假手术组开颅后注射等体积生理盐水。多奈哌齐组建模后第1天开始予盐酸多奈哌齐溶液0.21 mg/(mL·kg)灌胃，三甲散低、中、高剂量组建模后第1天开始分别予改良三甲散溶液1.25、2.5、5 g/(mL·kg)灌胃，模型组、假手术组同期予等体积生理盐水灌胃，各组均连续灌胃15天。

1.3 大鼠记忆能力检测 各组灌胃第3、7、15天进行跳台实验和水迷宫实验。①跳台实验：跳台底部为铜棒，可通电，跳台内放置一塑料安全台；预先将大鼠放入跳台熟悉环境，然后通电刺激，电压36 V，时间300 s；记录大鼠从受到电刺激至第一次跳上塑料安全台所需要的时间，即潜伏时间；实验重复3次，取平均值。②水迷宫实验：水迷宫分为四个象限，平台高于水面1 cm，水温(26±1)℃；记录各组2 min内找到平台的时间，即逃避潜伏时间；若2 min内未能找到平台，则逃避潜伏时间记录为2 min；实验重复3次，取平均值。

1.4 大鼠海马组织Aβ、NGF表达检测 采用免疫组化法。各组末次水迷宫实验后，颈椎脱臼法处死，开颅后取海马组织。海马组织经中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，4 μm厚切片。常规采用免疫组化法检测海马组织Aβ、NGF表达。所有操作严格按照试剂盒说明进行。显微镜下随机选取6个400倍视野，采用北航病理图像分析软件分析Aβ、NGF的光密度值，取其平均值作为海马组织Aβ、NGF表达。

2 结果

2.1 各组记忆能力比较

2.1.1 跳台实验潜伏时间 灌胃第3、7、15天，模型组潜伏时间均长于假手术组(P均<0.05)。灌胃第7天，多奈哌齐组及三甲散高剂量组潜伏时间均短于模型组(P均<0.05)，三甲散中、低剂量组潜伏时间与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。灌胃第15天，三甲散高、中、低剂量组及多奈哌齐组潜伏时间均短于模型组(P均<0.05)，多奈哌齐组及三甲散高剂量组潜伏时间与假手术组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组跳台实验潜伏时间比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与多奈哌齐组比较，△P<0.05。

2.1.2 水迷宫实验逃避潜伏时间 灌胃3、7、15天，模型组逃避潜伏时间均长于假手术组(P均<0.05)。灌胃第7天，三甲散高剂量组逃避潜伏时间短于模型组及改良三甲散低剂量组(P均<0.05)。灌胃第15天，多奈哌齐组及三甲散高、中剂量组逃避潜伏时间均短于模型组，且改良三甲散高剂量组缩短更明显(P均<0.05)。见表2。

表2 各组水迷宫实验逃避潜伏时间比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与多奈哌齐组比较，△P<0.05；与三甲散高剂量组比较，▲P<0.05。

2.2 各组海马组织Aβ及NGF表达比较 模型组海马组织Aβ表达高于假手术组，NGF表达低于假手术组(P均<0.05)。多奈哌齐组与三甲散中剂量组海马组织Aβ表达均低于模型组及三甲散高、低剂量组，海马组织NGF表达均高于模型组(P均<0.05)。见表3。

3 讨论

表3 各组海马组织Aβ及NGF表达比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与多奈哌齐组比较，△P<0.05；与三甲散中剂量组比较，▲P<0.05。

老年性痴呆的中医病理机制为肾虚髓空、痰瘀阻脑。Aβ是老年斑和淀粉样蛋白沉积的主要成分，可引起氧化应激反应、线粒体损伤，引发神经毒性作用，导致神经细胞增殖障碍，同时可激活凋亡相关蛋白和因子，启动细胞凋亡过程，引起痴呆相关的病理变化[7,8]；还可减少海马和脑皮质等释放乙酰胆碱，引起局灶性炎症反应，加重痴呆病情[9, 10]。NGF是神经系统重要的生物活性分子之一，可促进神经元成熟并维持其生存和功能。在病理状态下，NGF可降低缺血缺氧对神经元的损伤[11,12]。研究表明，NGF可增加脑组织胆碱能神经纤维数量，促进神经元损伤后恢复，改善老年性痴呆大鼠的学习记忆功能[13]。盐酸多奈哌齐属于胆碱酯酶抑制剂，是治疗AD的常用药物，能可逆性抑制乙酰胆碱酯酶引起的乙酰胆碱水解，增加受体部位的乙酰胆碱含量，继而改善记忆能力。改良三甲散的主要功效为填补肝肾真阴、活血通经、化痰透窍，既有重浊滋阴药，又有虫类活血化瘀药，寓补于通、寓通于滋、补而不腻、通而不破。本研究结果显示，灌胃第7天，多奈哌齐组及三甲散高剂量组潜伏时间均短于模型组，三甲散高剂量组逃避潜伏时间短于模型组及三甲散低剂量组；灌胃第15天，多奈哌齐组及三甲散高、中、低剂量组潜伏时间均短于模型组，多奈哌齐组及三甲散高、中剂量组逃避潜伏时间均短于模型组，且三甲散高剂量组逃避潜伏时间缩短更明显。表明改良三甲散灌胃可提高老年性痴呆大鼠的记忆能力，并具有剂量依赖性，且高剂量改良三甲散与盐酸多奈哌齐的治疗效果相当。

本研究结果显示，模型组海马组织Aβ表达高于假手术组，NGF表达低于假手术组；说明老年性痴呆大鼠海马组织Aβ清除和代谢发生障碍，其神经毒性作用造成大脑海马和皮质神经元损伤，而NGF表达降低造成脑组织某些神经胺类递质的减少，从而影响中枢神经递质的正常功能，导致神经细胞衰老、记忆能力减退。本研究多奈哌齐组与三甲散中剂量组海马组织Aβ表达均低于模型组及三甲散高、低剂量组，海马组织NGF表达均高于模型组；提示中剂量改良三甲散对Aβ、NGF表达的调节作用与盐酸多奈哌齐相当。

综上所述，改良三甲散灌胃可提高老年性痴呆大鼠的记忆能力，并具有剂量依赖性；其作用机制可能与降低海马组织Aβ表达、提高NGF表达有关。但本研究结果在量效关系上并未完全同步，如中剂量改良三甲散在调控Aβ、NGF表达上效果最佳，而高剂量改良三甲散改善记忆能力效果更明显，提示改良三甲散亦可能通过调控其他通路或蛋白表达而改善痴呆大鼠的记忆能力。

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国家自然科学基金面上项目(81173313)。

刘涛(E- mail： 13952091103@139.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.011

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1002- 266X(2017)36- 0037- 03

2017- 01- 24)