HLA新等位基因HLA-B*67：07测序分析及确认*

王天菊 陈利萍 王小芳 王满妮 齐珺

·血型与临床·

HLA新等位基因HLA-B*67：07测序分析及确认*

王天菊 陈利萍 王小芳 王满妮 齐珺

目的 人类白细胞抗原B新等位基因核苷酸序列分析及确认。 方法 采用序列特异性寡核苷酸探针技术（SSO）对2015年中国造血干细胞捐献者资料库（CMDP）入库数据进行HLA常规检测，结果显示有1个磁珠反应异常，进一步选择多聚酶链反应-测序（PCR-SBT）分型发现1个与HLA-B*67相关的有1个碱基不匹配的等位基因，选择对应的组特异性引物对该等位基因进行2次分离式测序，确认突变的等位基因和突变位点。 结果 发现 1 个与HLA-B*67：01：01序列相近的新等位基因，实验结果表明在HLA-B*67：0：01第3 外显子370位置G＞A，其突变造成HLA-B*67：01：01氨基酸序列中100位的氨基端由甘氨酸（Gly）变成丝氨酸（Ser）。 结论 本次实验确认了1个新的HLA等位基因，2016年3月30日被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*67：07。

人类白细胞抗原 测序 组序列特异性引物 新等位基因

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是人类最复杂、最具有多态性的免疫遗传系统，在自我识别和免疫应答中发挥重要作用。自1958年首个HLA抗原被检出至今，截至2016年7月更新的国际免疫遗传IMGT/HLA 数据3.25版显示，共检出等位基因HLA-A 3 492种、HLA-B 4 358种、HLA-C 3 111种、HLA-DRB1 1 929种、HLA-DQB 940种。HLA在造血干细胞移植中具有重要意义，供者与受者HLA是否相合与移植后移植物抗宿主病的发生率和移植物的存活密切相关。近年来，随着分子生物学检测技术的进步，新的检测技术不断应用于HLA分型。随着中国造血干细胞志愿捐献者人数的增多，越来越多的HLA新基因被报道。对中国造血干细胞捐献者资料库样本进行HLA-A/B/DRB1位点常规检测时，发现1个疑似新等位基因，经确证实验验证后将序列上传到世界基因库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank Bankit）比对核准，经向世界卫生组织（WHO）提交一系列信息后，序列2016年3月30号被HLA因子命名委员会正式命名为HLAB*67：07。

对象与方法

1 研究对象 先证者为中华骨髓库陕西分库造血干细胞志愿捐献者，陕西籍，汉族，男性。对HLA-A、B、DRB1位点做测序基因分型时发现HLA-B位点与已知序列库无匹配结果，与常见等位基因组合有1个碱基不匹配，进而对该样本进一步分析。

2 主要仪器及试剂

2.1 主要仪器：生物安全柜（型号BSC-10001，苏州安泰空气技术有限公司）；核酸检测仪（型号GeneQuant pro，Biochrom公司）； PCR扩增仪（型号SENSOQUEST，圣欧国际有限公司）；流式微磁珠分析仪（型号IS-200，Luminex公司）；DNA测序分析仪（型号3730xl，ABI公司）。

2.2 试剂：北京天根血液基因组DNA提取试剂盒（批号DP318，北京TIANGEN）；LABTypeTM RSSOH1A/1B/2B1试剂盒（批号：009，009，009，Luminex公司）；SeCore® HLA-SBT分型试剂盒（批号1249290，1249289，1275334，life公司）。

3 方法

3.1 标本采集和基因组DNA提取：采集志愿捐献者外周静脉血5 ml（EDTA抗凝），采用北京天根血液基因组DNA提取试剂盒，严格按照试剂操作说明提取血液基因组DNA，利用GeneQuant核酸蛋白测定仪测定所提取DNA的浓度和纯度，此标本的浓度为56 ng/μl，纯度A260 nm/280 nm为1.82。

3.2 PCR-SSO方法检测：选择基于Luminex平台的聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probes，PCR-SSO）方法，采用LABTypeTM RSSOH1A/1B/2B1试剂盒进行样本的HLA-A、B、DRB1基因分型。将提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物与标记有荧光的特异性探针磁珠杂交后，用Luminex IS-200流式微磁珠分析仪检测，结果判读应用与试剂盒对应的HLAFusion 2.0软件判读，根据DNA与每个磁珠探针的反应格局，自动给出HLA-A、B、DRB1各基因座位的分型结果。

3.3 PCR产物直接测序（sequence-based typing，SBT）：采用SeCore® HLA-SBT分型试剂盒对该样本HLA-A、B、DRB1位点进行常规高分辨的HLA基因分型。对提取的DNA进行HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位点的PCR扩增，扩增产物用ExoⅠ/SAP酶纯化后，对HLA-A、HLA-B进行第2、3、4外显子正反向测序反应和对HLA-DRB1进行第2外显子正反向及Condon86正向测序反应，测序产物再经过乙醇/醋酸钠沉淀，95℃热变性迅速冷却后的产物用ABI 3737xl测序仪进行毛细管电泳，将电泳序列导入uTYPE®分析软件进行分析后，发现HLA-B位点无法生成确切的结果，与常见等位基因组合存在不可修改的不匹配碱基峰，所以进一步实验确定是否有碱基突变。

3.4 组特异性DNA序列分析：根据分析软件提示结果，进一步选择组特异性引物Z52、Z76，对PCR扩增纯化后的产物进行2次分离式测序反应，将GSSP结果与上一步测序反应的序列共同导入uTYPE®软件进行分析。

结 果

1 样本PCR-SSO分型结果 该样本A、DRB1位点的分型结果为：HLA-A*02：01：01G，33：03：01G；HLA-DRB1*01：01：01G，12：01：01G；B位点显示586号磁珠反应异常，从结果来看586号磁珠应该为阴性（见图1黑色箭头标识），而分析软件显示若结果是B*58：01：01，67：01：01组合的话，586号磁珠是假阴性。

2 PCR-SBT分型结果 该样本A、DRB1位点的分型结果为HLA-A*02：01，33：03；HLADRB1*01：01，12：01G；B位点的分型结果相对于HLA-B*58：01，67：01在第3外显子370位碱基有1个碱基不匹配，测序结果显示结果有2种组合HLA-B*38：26，58：64与HLA-B*58：01，67：01在370位碱基应该为G，但该样本在这个位置为R（A/G），见图2。有可能该位置有突变，应进行GSSP测序。

3 组特异性引物对该样本HLA-B序列的进一步确认 根据软件提示，用组特异性引物Z52、Z76对样本B位点双链扩增结果进行分离式测序，Z52是HLA-B*58：01的特异性引物，证明在370位碱基位置HLA-B*58：01为G，见图3。因此HLAB*67：01在370的位置为A，但是根据已公布的B*67：01序列在此位置应为G，所以进一步确定此位置的碱基发生了G＞A突变。

4 新等位基因HLA-B*67：07核苷酸和氨基酸序列比对 B位点的测序反应是对2、3、4外显子的正反向测序，测序长度（bp）分别为270、276、276，未知基因与同源性最高的等位基因HLAB*67：01：01相比，第3外显子编码序列发生370位G＞A的突变，见图4；两者的氨基酸序列比对见图5，第3外显子第100位密码子由GGC＞AGC，氨基酸由甘氨酸（Gly）变成丝氨酸（Ser）。将所检测到的2、3、4外显子序列提交给GenBank，获得登录号为KT285900。将新等位基因相关数据上报给WHO HLA因子命名委员会，被正式命名为HLA-B*67：07。

图1 HLA-B位点 PCR-SSO探针反应格局

图2 先证者HLA-B位点杂合测序结果

图3 先证者HLA-B位点GSSP测序结果

图4 HLA-B*67：01：01与HLA-B*67：07核苷酸序列比对图

图5 HLA-B*67：01：01与HLA-B*67：07氨基酸序列比对图

讨 论

HLA的编码基因位于人类第6号染色体短臂6P21.31区域，全长3600 kb，HLA按编码分子特性的不同分为HLA-I、II、III类基因，HLA-B属于HLA-I类基因，HLA-I类基因以糖蛋白的形式表达在有核细胞细胞膜表面。HLA-I类分子重链（α链）胞外段有3个结构域（α1、α2、α3），远膜端的2个结构域α1和α2构成抗原结合槽，是抗原肽识别的部位；α3和β2-m属于免疫球蛋白超家族（IgSF）结构域。已经证实HLA-I类基因的第2、3、4 外显子分别编码α链的α1、α2、α3结构域，本例确认的新等位基因是在第3外显子发生1个碱基突变，并导致相应的氨基酸发生了改变，α2结构域氨基酸的替换可能会影响抗原结合的特异性。

HLA分型技术应用于临床检测的主要有PCRSSP、PCR-SSO、DNA测序和基因芯片等。PCRSSP、PCR-SSO基于已知序列设计引物，依据指定反应格局由软件分析导出结果，针对罕见等位基因分析时，有可能提示假阳性或假阴性。在临床工作中，若出现反应格局异常或出现异常的假阳性或假阴性提示时，应采用不同的方法验证结果，一般选择测序分析，保证结果的真实性和准确性。本实验检测采用流式磁珠反向SSO的方法，其原理是对检测样本利用标记生物素的引物进行PCR扩增后，将扩增产物与磁珠杂交，磁珠上标记有2种不同比例的荧光素，不同的磁珠上标记不同的探针，荧光染色后检测磁珠的荧光强度和DNA上标记的荧光强度，通过对所有磁珠信号的组合，利用HLAFusion 2.0软件进行识读和判断。该样本在最初的PCR-SSO检测基因分型时发现HLA-B分型中显示586号探针反应格局异常，真阴性反应软件提示为假阴性，因此怀疑有新基因存在的可能性，进一步用DNA测序对该样本进行检测。SBT能够直接从碱基水平得到HLA的等位基因序列，从而得到高分辨结果，但是对于新等位基因的检测，若2条等位基因为纯合子，SBT可以检测出突变位置的等位基因；但是对于杂合子，SBT是对DNA双链的双向测序，无法确定突变位于哪条DNA链上。为准确区分突变位置，采用组特异性引物测序的方法，选取Z52、Z76两个特异性引物进行单链测序，确定了新等位基因HLA-B*67：07。此次报道的HLA-B*67：07先证者为陕西籍汉族，在2010年本实验室开展对HLA进行SBT检测后，在对15 000份造血干细胞捐献者的检测中未发现该基因，所以推测HLA-B*67：07为罕见型，此等位基因的频率还需进一步的数据研究。

目前国际上已检出HLA-B*67等位基因9个（IPD-IMGT/HLA Release 3.24.0，2016-04-15），包括HLA-B*67：01：01、B*67：01：02、B*67：01：03、B*67：02、B*67：03、B*67：04、B*67：05、B*67：06、B*67：07。根据中国常见及确认的HLA等位基因表（CWD）（2.2版），HLA-B*67：01的频率为0.717 78，HLA-B*67：03的频率为0.000 42，其他等位基因均罕见。HLA在不同种族和地域有很强的差异性。HLA-B*67：01在北方汉族的基因频率为0.87%[1]，HLA-B*67：01在江苏汉族人群中的频率为0.70%[2]，根据黑爱莲报道中华骨髓库造血干细胞捐献志愿者HLA-B*67：01的频率为0.28%[3]，HLA-B*67在安徽汉族的基因频率为0.73%[4]， 福 建 为 0.41%[5]， 广 东 为 0.62%[6]， 湖 北汉族为0.64%[7]，吉林汉族为1.15%[8]，云南地区为0.21%[9]。李翠莹等对中华骨髓库陕西分库10 122名汉族造血干细胞捐献者HLA等位基因分析后得出HLA-B*67的频率为0.94%[10]。HLA抗原具有高度遗传多态性，主要表现在同一基因座位等位基因的高度多态性，在机体的免疫应答启动和免疫调节中发挥重要作用，HLA与疾病的相关性研究有很多报道。HLA-B*67频率相对较低，与疾病相关的报道较少。对多发性大动脉炎的研究中发现HLA-B*67：01是疾病的易感基因，在 Terao等的研究中发现，多发性大动脉炎多发于年轻女性，环境和基因因素共同影响疾病的发生和发展，除之前已发现的HLA-B*52：01是多发性大动脉炎的易感因素，相对频率较低的HLA-B*67：01也是易感因素[11，12]。在对日本人群中HLA-I类等位基因与HIV-1感染者疾病进展相关性研究中发现，HLA-B*67：01，B*52：01和C*12：02三个等位基因与低病毒载量和高的CD4 T细胞数量相关[13]。

从1993年HLA-B*67：01：01和1995年HLAB*67：01：02被报道以来，HLA-B*67：01：03、HLA-B*67：02、HLA-B*67：03、HLAB*67：04、HLA-B*67：05、HLA-B*67：06、HLA-B*67：07分别在2013、2000、2010、2013、2014年及2016年发现。随着基因分型技术的广泛应用和测序技术的发展、中华骨髓库的壮大、造血干细胞志愿捐献者的增多，越来越多的新基因不断被发现和报道。新基因的确认和命名不断丰富了HLA等位基因数据库，为造血干细胞移植提供数据支持，能更准确地寻找最适合的供者，减少急性排斥反应的发生和对抗排斥反应药物的依赖；为进一步研究HLA与疾病的相关性和群体遗传学研究提供基本数据。

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12 Terao C. Revisited HLA and non-HLA genetics of Takayasu arteritis-where are we[J]，Journal of Human Genetics，2016，61∶27–32.

13 Naruto T，Gatanaga H，Nelson G，et al. HLA Class I-Mediated Control of HIV-1 in the Japanese Population，in Which the Protective HLA-B*57 and HLA-B*27 Alleles Are Absent[J]. Journal of Virology，2012，86（19）：10870-10872.

Objective To identify a novel HLA-B allele in Chinese hematopoietic stem cell donors．Methods A rare HLA-B allele was initially detected by Luminex PCR-SSO typing，then the sample was sequenced by sequence-based typing （SBT） and the group-specific sequencing primer（GSSP） to confirm the mutation allele and locus. Results The sequence of the novel allele was different from that of B*67：01：01 at the position 370（G＞A） in exon 3，which results in an amino acid change from Gly to Ser at codon 100. Conclusion This allele is a new HLA-B allele which has been designated as HLA-B*67：07 by the World Health Organization（WHO） HLA Nomenclature Committee.

Human leukocyte antigen Sequence based typing Group-specific sequencing primer Novel allele

R392.4 R457.1

A

1671-2587（2017）05-0482-05

A Novel HLA-B*67：07 Allele was Identified by Polymerase Chain Reaction-Sequence Based Typing WANG Tianju，CHEN Li-ping，WANG Xiao-fang，et al. Shaanxi Blood Center，Xi’an 710061

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.000

*本课题受中国造血干细胞捐献者资料库（CMDP）资助

710061 西安，陕西省血液中心

王天菊（1984–），女，山西临汾人，主管技师，硕士，主要从事HLA分型确认工作，（Tel）15353557936（E-mail）wangtianju2007@163.com。

齐珺，（Tel）029-85253575（E-mail）qijun0802@163.com。

2017-01-30）

（本文编辑：潘健）