狗獾东北亚种冬眠期与非冬眠期血液生化指标的对比研究

冯成武李彦东王冬梅邹爱红刘玉堂*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040 ；2.东北林业大学医院，哈尔滨，150040)稿件运行过程

狗獾东北亚种冬眠期与非冬眠期血液生化指标的对比研究

冯成武1李彦东1王冬梅1邹爱红1刘玉堂1*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040 ；2.东北林业大学医院，哈尔滨，150040)稿件运行过程

狗獾；冬眠；血液；生化指标；能量代谢

狗獾东北亚种(Melesmelesamurensis)具有较长的冬眠期，冬眠期间的脂肪代谢及骨钙平衡等特殊生理机制具有极其重要的医学研究价值。本实验于冬眠期与非冬眠期随机选取37只健康的雄性狗獾，分成冬眠组(14只)和非冬眠组(23只)，空腹采集上述2组动物的血液，利用全自动生化分析仪对29项血清生化指标进行检测，比较其生化指标间的差异，分析机体内能量代谢和营养状况等方面的变化。研究结果表明非冬眠组血糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)含量显著低于冬眠组，而碱性磷酸酶(ALP)、r-谷氨酰转肽酶(GGT)、钙(Ca)含量在冬眠期则显著降低。其余指标间无统计学上的显著差异。在冬眠期，血糖和乳酸脱氢酶含量升高可能与维持某些必要的生理活动和酸碱平衡有关，碱性磷酸酶、r-谷氨酰转肽酶、钙含量显著降低则可能是为了减少能量消耗。这些生化指标的变化与其长期进化而形成的半冬眠的特性有关，是机体与外界环境相适应的表现。

狗獾(Melesmeles)属食肉目(Carnivora)鼬科(Mustelidae)狗獾属，为营半地下生活的穴居动物，具半冬眠特性，冬眠期从11月到次年3月末[1-3]。广泛分布于欧亚大陆，共有24个亚种的分化，中国境内有6个亚种，其中东北亚种主要分布在大小兴安岭、长白山和平原地区[4-6]。狗獾是我国珍贵的毛皮、药用动物，具有非常重要的经济和科研价值，其冬眠时期特殊的生理变化机制能够为医学研究提供启示。狗獾在秋末囤积大量脂肪，可达夏季体重的1倍，却不会对身体健康造成类似于人类因肥胖导致的二型糖尿病的伤害。此外，在长达4个月的冬眠期间未出现肌力减弱、骨质疏松等问题，这其中蕴藏的生理机制具有重要的医学研究价值[2]。然而，到目前为止，国内外的学者对狗獾进行了生态学、解剖学、行为学、繁殖学、营养学、仿生学以及产品加工等方面的研究，对其生理方面的研究仍比较少。血液作为重要的生物指标之一，在动物体内维持机体正常生命活动，它能客观反映动物机体的代谢和营养状况以及生理性或病理性变化等，有助于疾病早期发展情况的鉴定[7]。通过对冬眠和非冬眠期狗獾东北亚种血液理化指标的检测和比较研究，有利于了解动物体内的能量代谢和营养状况，为狗獾血液理化指标的季节性变化提供参考范围，为狗獾定向消耗脂肪而不对身体其他组织器官产生损害的代谢机制和二型糖尿病的进化生物学原理提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验用狗獾由哈尔滨东林獾子饲养有限公司提供。随机选取37只健康的雄性狗獾东北亚种，其中包含不同年龄的个体，以期所提供的参考范围更为准确。

1.2 试剂与仪器

全自动生化分析仪(贝克曼DXC800，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)，离心机(HERMLE Z383K，上海泽权仪器设备有限公司)，真空采血管(湖南省浏阳市医用仪器厂生产)，鹿眠宝3号、鹿醒宝3号(青岛汉河动植物药业有限公司生产)。

1.3 血液标本的采集与检测

非冬眠期血液样本采集前进行空腹处理12 h。实验动物保定后注射鹿眠宝进行麻醉，用一次性使用人体静脉血样采集容器以心脏采血的方式抽取血液，而后注射鹿醒宝3号进行解麻醉。采集的血液在3 h之内用离心机以4 000 r/min离心5 min，取上清液，应用贝克曼DXC800全自动生化分析仪进行常规血液生化指标的检测。

1.4 测定项目

本次实验分别对狗獾东北亚种冬眠期与非冬眠期29项血液生化指标进行了检测。包括血糖(GLU)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(URIC)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、r-谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、间接胆红素(IBIL)、低密脂蛋白(LDL-C)、白球比例(A/G)、α-羟丁酸脱氢酶(HBDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、AST：ALT、CO2、K、Na、Cl、Ca。

1.5 数据处理

所有数据利用Excel(Microsoft Office 2013)和统计软件R(R version 3.3.1)进行汇总。利用F检验和成组数据t检验分析各理化性质的差异显著性(显著水平α=0.05)，数据以平均值±标准误(Mean±SE)的方式表示。

2 结果与分析

狗獾东北亚种冬眠期与非冬眠期血液生化指标测定结果t检验表明，非冬眠组血糖(GLU)(P<0.05)、乳酸脱氢酶(LDH)(P<0.05)含量显著低于冬眠组，而碱性磷酸酶(ALP)(P<0.01)、r-谷氨酰转肽酶(GGT)(P<0.05)、钙(Ca)(P<0.05)在冬眠期则显著降低。余下的24项指标间差异不显著，除了尿素氮含量、AST：ALT、CO2和血清无机离子浓度在冬眠期有所降低外，其余指标冬眠期的含量均高于非冬眠期(表1)。

表1 狗獾东北亚种生化指标测定结果

Tab.1 Measured results of biochemical indexes in badger(Meles meles amurensis)

注：表中数据所示平均值±标准误(Mean±SE)，同行中相同字母表示差异不显著(P>0.05)

Note：Data are presented as Mean ± SE，the same letter in a row means no significant differences(P>0.05)

3 讨论

冬眠动物进入冬眠期具有一定的周期性，机体内的能量代谢和营养状况也发生相应的季节性变化，这些变化是生物在不断进化过程中形成的对不良环境的适应。

3.1 血清蛋白和非蛋白氮

血清总蛋白(TP)是由白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)组成，具有维持血浆胶体渗透压，作为载体运输脂质、维生素等，参与血液凝固、抗凝和纤溶等生理过程，抵御病原微生物和营养等功能[8]。血清白蛋白主要与维持正常的胶体渗透压有关。球蛋白的主要功能是抵御病原微生物，参与免疫过程。白蛋白与球蛋白的比值维持在一定范围，为维持机体内环境稳态起到至关重要的作用，具有重要的医学临床价值。本实验测得，狗獾东北亚种血液中总蛋白含量、白蛋白含量和球蛋白含量间无明显的季节性差异，但冬眠期间血液蛋白质的浓度均有所提高，这可能与冬眠期血液黏稠度较高有关，而血液蛋白含量升高可能有利于血液胶体渗透压的维持和病原微生物的免疫。

血浆中除蛋白质以外的含氮化合物总称为非蛋白含氮化合物，主要包括尿素氮(BUN)、尿酸(UA)和肌酐(CREA)等，它们分别是蛋白质、嘌呤和肌酸代谢的终末产物。通过肾脏作用后从尿液排出[9]。本实验测得尿素氮、尿酸和肌酐含量不存在季节性显著差异。除尿素氮含量在冬眠期有所降低外，其余的非蛋白氮含量在冬眠期间均有所上升。血清尿素氮含量能够较准确地反映机体蛋白质的分解代谢和肾功能[10]。狗獾血液尿素氮含量降低可能与冬眠期间蛋白质分解活动减弱有关。尿酸是嘌呤的代谢终产物，细胞分解代谢的核酸和其他嘌呤类化合物以及食物中的嘌呤经过一系列酶的作用生成次黄嘌呤和黄嘌呤，在黄嘌呤氧化酶作用下生成UA[11]。肌酐是肌肉在机体内代谢后的产物，主要由肾小球滤过后排出体外。外源性肌酐是体内肌肉组织代谢后的产物[12]。二者在冬眠期间含量有所增加可能与狗獾的冬眠特性有关，在冬眠期间狗獾不饮不食不尿，肾脏几乎停止工作，导致尿酸与肌酐含量在体内累积。

3.2 血糖

血糖是机体进行正常生命活动的必要生活物质，生物通过食物中糖的消化吸收、肝糖原分解和糖异生作用获得，通过氧化供能、合成糖原、转变为其他物质消耗。获得与消耗之间存在着动态平衡，使血糖浓度在较小的范围内波动。因此，血糖含量的测定是反映机体内糖代谢状况的一项重要指标。本实验中测得，在冬眠期狗獾的血糖含量显著高于非冬眠期，说明血糖是狗獾冬眠期不可缺少的能源物质。这与白条锦蛇(Elaphedione)、黑斑侧褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)和山蝠(Nyctalusnoctula)血糖季节性变化相一致，与深冬眠动物刺猬(Erinaceusamurensis)、蒙古黄鼠(Spermophilusdauricus)、草原旱獭(Marmotabobak)的研究结果相反[13-16]。 我们认为除了种的差别外，还与其自身的冬眠模式有关。血糖是两栖爬行类动物抵抗寒冷的低温保护剂[17]。而狗獾血糖浓度的提高，可能与其半冬眠的特性有关。半冬眠动物在冬季呈麻痹状态，但体温不降低或降低少许，且易觉醒。在低温条件下，狗獾通过增加某些必要生理活动的代谢率提高机体抵御外界温度变化的能力，使其在冬眠期保持警觉和易觉醒，能够对外界不利环境做出调整，以避免对机体造成损伤。狗獾冬眠过程中，作为占体重1/3～1/2的脂肪组织被转化为营养和能量而消耗掉，血糖含量伴随着体脂积累而升幅较高，保证了在低温条件下狗獾的必要生理活动能够正常进行。这种脂肪组织的积累和消耗过程，类似于人类二型糖尿病，能够为医学研究提供启示，为治疗二型糖尿病提供参考方案。

3.3 血清酶类

酶是一类由生物机体产生并具有高度特异性的生物催化剂，反映了机体的代谢水平，可作为临床诊断的重要依据[18]。谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是目前动物体内发现的活力最强的2种转氨酶，在动物氨基酸代谢中占有极其重要的作用[10]。AST和ALT在肝脏、心脏、骨骼肌、肾脏中含量较多，其活性高低反映了蛋白质的合成和分解代谢状况。本实验测得，在冬眠期间狗獾血液谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量均有所增加，这可能与冬眠时氨基酸通过转氨基作用被分解提供能量有关[19]。肌酸激酶(CK)广泛分布于组织细胞的胞浆和线粒体，催化肌酸和三磷酸腺苷反应生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷之间的可逆反应，由于肌酸激酶与能量的产生相关，所以冬天为了抵御严寒，狗獾血液中肌酸激酶含量上升，产生更多的热量。这与狗獾的生理习性相一致[12]。乳酸脱氢酶(LDH)存在于机体所有组织细胞的胞质内，是能够催化丙酮酸生成乳酸的糖酵解酶。LDH合成增加时释放到血液中，导致血清LDH水平升高[20]。对冬眠期与非冬眠期狗獾血清酶类的测定结果显示，冬眠期血清LDH含量显著升高。生物体在相对缺氧条件下，糖酵解是糖分解的主要形式，也是获得能量的主要方式[21]。这种方式能够降低能量消耗，适应冬眠期无食物摄入和洞穴缺氧的环境[17，22]。碱性磷酸酶(ALP)是广泛存在于机体肝脏、骨骼、肾等各组织的一种酶，血清中ALP主要来自于骨骼，由成骨细胞产生，它的活力反映机体的成骨作用程度和骨代谢率，Pond认为血清ALP能促进磷酸钙储存于骨骼内而参与骨骼钙化过程[23-24]。冬眠期ALP含量降低表明成骨细胞的活性降低，该变化与冬眠期黑熊(Ursusthibetanus)血液中成骨作用标志性分子降低的趋势相同[25]。研究表明，正常生理状况下，当细胞外液Ca2+浓度降低时，骨骼必须释放一些钙来维持细胞外液钙离子浓度稳定[26]。本实验测得狗獾东北亚种在冬眠期间钙离子浓度显著降低，在冬眠期没有通过肠道吸收和肾脏排除钙的情况下，也未发生利用骨钙补充血钙减少使其恢复正常的现象，由于ALP冬眠期显著降低，因此可以推测狗獾冬眠期保持骨骼强壮的机制很可能是通过抑制骨重塑机制来完成的[23]。该生理机制的变化可能为揭示冬眠动物在长期冬眠过程中未出现肌力减退和骨质疏松的现象提供启示。血清r-谷氨酰转肽酶(GGT)主要来源于肝胆系统，是一种膜结合酶，参与谷胱甘肽的氨基酸跨膜转运。冬眠期GGT含量下降表明氨基酸的转运受到抑制，这与东北刺猬血清GGT的季节性变化不同[27]。我们认为GGT含量的下降与狗獾在冬眠期间保持较低的代谢率有关，通过减少氨基酸代谢减少能量消耗。

3.4 血脂类

血清中主要的脂类有胆固醇、甘油三酯、磷脂和游离脂肪酸[28]。血清中CHOL、TG、HDL-C、LDL-C的含量是机体内脂类代谢的重要指标。本实验测得总胆固醇、甘油三酯、高密脂蛋白和低密脂蛋白含量在冬眠期与非冬眠期之间无显著差异。但在冬眠期间数值均有所上升。这与白条锦蛇和东北刺猬的变化趋势相一致[13，27]。高密脂蛋白将各组织的胆固醇运送回肝进行代谢，低密脂蛋白把胆固醇从肝脏运送到全身组织。低密脂蛋白和高密脂蛋白的变化与胆固醇的变化趋势相一致。血清中甘油三酯主要来源于脂肪组织，它的升高可能有利于狗獾在低温下保证机体所必需的生理活动[13]。

3.5 血清胆红素

血清中的胆红素大部分是来源于衰老红细胞被破坏后产生出来血红蛋白衍化而成的，在肝内经过了葡萄糖醛酸化叫作直接胆红素，没有在肝内经过葡萄糖醛酸化的叫作间接胆红素，二者和就是总胆红素[12]。本实验测得总胆红素、直接胆红素和间接胆红素含量在冬眠期均有所上升，但三者之间无显著差异。血清胆红素含量的上升可能与狗獾在冬眠期间不饮不食不尿的生理状态有关，导致血清胆红素在体内积累。

3.6 血清无机离子

本实验测定了K、Na、Cl、Ca 4种离子的含量，结果显示，K、Na、Cl在冬眠期与非冬眠期差异不显著，Ca浓度在冬眠期显著降低。这与离子的作用有关，K、Na、Cl在维持机体内环境的稳态中起着至关重要的作用。Ca起着维持细胞膜两侧的生物电位，维持正常的肌肉收缩功能以及神经传导功能[12]。冬眠期动物处于静止状态，具有较低的代谢率，因此Ca离子浓度也会适应性的降低。与冬眠期黑熊血液中Ca离子未发生变化不同，暗示机体内存在如前所述的其他机制来调节血液中钙离子的含量[24]。

3.7 二氧化碳

冬眠期与非冬眠期狗獾血液二氧化碳浓度无显著差异，这说明保持冬眠期间血液中CO2含量相对稳定，对于维持机体内的酸碱平衡非常重要。这与李梦华等冬眠黄鼠血液中CO2浓度升高的研究结果不同[15]。除了种的差别外，我们认为这也跟狗獾半冬眠的特性有关。黄鼠进入冬眠状态后，体温显著下降，且伴随出现呼吸、心跳、耗氧量的锐减，呈典型的连续冬眠并没有醒觉交替。在此期间，血液中CO2浓度升高[29]。狗獾在觉醒时能够排出一部分的CO2，且狗獾在冬眠期间LDH含量上升，而LDH同工酶LDH-1的主要作用是催化乳酸氧化[30]。

动物血液生化指标值受年龄、性别、体重、健康状况、营养水平、环境条件、测定方法、样本量、动物应激以及冬眠组不同个体采血时间距其阵间觉醒的日数长短等多方面的影响[16，31]。对于动物血液理化性质的研究，目前尚缺乏相应的标准，对于动物冬眠时期生理状态的变化机制还有待进一步研究。

4 结论

狗獾东北亚种血液生化值在一定程度上反映了机体的能量代谢和生理状况。非冬眠组血糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)含量显著低于冬眠组，而碱性磷酸酶(ALP)、r-谷氨酰转肽酶(GGT)、钙(Ca)在冬眠期则显著降低。狗獾在冬眠期间，一方面通过增加血糖含量来维持某些必要或应激性生理活动，另一方面减少不必要的消耗，减少能量损失。余下的24项指标间差异不显著，除了尿素氮含量、AST：ALT、CO2和血清无机离子浓度在冬眠期有所降低外，其余指标冬眠期的含量均高于非冬眠期。这些指标的变化有利于适应冬眠期无食物摄入和低温缺氧的洞穴条件，是机体与外界环境相适应的表现。这些指标的获得为建立狗獾血液生化指标参考范围提供了依据，为进一步研究狗獾定向消耗脂肪的代谢机制和治疗二型糖尿病奠定基础。

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Badger；Hibernation；Blood；Biochemical index；Energy metabolism

Blood Biochemical Indexes of Badger (Meles meles amurensis) During Hibernation and Non-hibernation

Feng Chengwu1Li Yandong2Wang Dongmei2Zou Aihong2Liu Yutang1*

(1.College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China；2.Hospital of Northeast Forestry University，Harbin，150040，China)

The physiological mechanisms of fat metabolism and calcium homeostasis are of interest in medical research on long hibernation periods as experienced by badger (Melesmelesamurensis).Thirty-seven healthy male badgers were randomly selected and divided into the hibernation (14 badgers) and non-hibernation (23 badgers) groups according to their hibernation state. Blood samples were taken in fasting state，and 29 serum biochemical indexes of the blood were detected by automatic biochemical analyzer. The differences of biochemical indexes between two groups were compared and the changes were analyzed with reference to energy metabolism，trophic status and other functions.The contents of blood glucose and lactic dehydrogenase of the non-hibernation group were significantly lower than those of the hibernation group.But mean content of alkaline phosphatase，r-glutamyl transpeptidase and calcium of the non-hibernation group were significantly higher than of the hibernation group.Other indexes were similar for both groups.During hibernation，elevated blood glucose and lactate dehydrogenase levels might be related to maintaining necessary physiological activities and blood pH.The contents of alkaline phosphatase，r-glutamyl transpeptidase and calcium were significantly reduced for reducing energy consumption.These changes in biochemical indicators are related to the characteristics of the semi-hibernation formed in long-term evolution，which is the performance of acclimation between body and environment.

2017-03-15

修回日期：2017-04-25

发表日期：2017-11-10

Q592.1

A

2310-1490(2017)04-593-06

东北林业大学大学生创新训练项目；国家林业局野生动植物保护司项目

冯成武，男，21岁，本科生；主要从事野生动物与自然保护区管理研究。E-mail：Feng_chengwu@163.com

*通讯作者：刘玉堂，E-mail：liu-yutang@ foxmail.com