玉屏风颗粒对过敏性紫癜患儿Th17/Treg细胞失衡的调节作用

段 炤 林智平 彭 宇 徐 琨 邓宇虹 王 智 李 琳

玉屏风颗粒对过敏性紫癜患儿Th17/Treg细胞失衡的调节作用

段 炤1林智平2*彭 宇1徐 琨1邓宇虹1王 智1李 琳1

（1 江西省儿童医院风湿免疫科，南昌 330006；2 江西省南昌市中西医结合医院消化科，南昌 330003）

目的 观察过敏性紫癜（HSP）患儿外周血Th17细胞及其相关因子IL-17和Treg细胞的水平，探讨玉屏风颗粒在调节HSP患儿Th17/Treg细胞失衡的作用以及治疗HSP的疗效。方法 将确诊为过敏性紫癜初发的50例儿童，随机分为常规治疗组和玉屏风治疗组，各25例，疗程2周。25名同年龄段儿保科健康体检儿童为健康对照组。分别抽取健康对照组、常规治疗组和玉屏风治疗组治疗前后静脉血，采用流式细胞术检测外周血CD4+CD25+调节性T细胞（Treg)和Th17细胞比例；ELISA法检测血浆中IL-17水平。结果 常规治疗组总有效率为68%，玉屏风治疗组总有效率为96%，2组比较有显著性差异（P＜0.05）。常规治疗组和玉屏风治疗组患儿外周血Th17细胞数及其相关因子IL-17水平较健康对照组明显增高（均P＜0.05），Treg细胞数较健康对照组明显降低（均P＜0.05），但常规治疗组患儿Th17、Treg细胞数和IL-17水平与玉屏风治疗组患儿比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。常规治疗组治疗后Th17细胞数、IL-17水平较治疗前有所下降，Treg细胞数较治疗前有所升高，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。玉屏风治疗组治疗后Th17细胞数、IL-17水平较治疗前和常规治疗组治疗后明显下降（P＜0.05），Treg细胞数较治疗前和常规治疗组治疗后明显增高（P＜0.05）。结论 HSP患儿存在显著的Th17细胞及IL-17水平增高和Treg细胞减少。玉屏风颗粒能在一定程度上降低Th17细胞及IL-17水平，升高Treg细胞水平，增加HSP的疗效。

玉屏风颗粒；过敏性紫癜；Th17；Treg；中成药疗法；肌衄；中成药疗法

过敏性紫癜又称亨-舒综合征（Henoch-Schonlein purpura，HSP），中医归属于“血证”“紫斑”“肌衄”等范畴，是儿童时期较为常见的一种自身免疫性血管炎性疾病。其临床表现以皮肤紫癜、粘膜出血为主，常伴有消化道、关节及肾脏等多系统器官损坏。该病好发于春秋季节，常有上呼吸道感染病史，其发病率近年来有逐渐上升的趋势[1]。HSP的病因复杂，具体发病机制至今尚未完全阐明，目前公认免疫功能紊乱介导的血管炎是其主要发病机制。Th17细胞是一类有别于传统Th1、Th2细胞的CD4+辅助性T细胞亚群，它可通过分泌IL-17等多种前炎性细胞因子和趋化因子，参与机体炎症反应，对多种免疫性疾病的发生发展起促进作用[2-3]。CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+regulatory T cells)是一类具有免疫调节功能的T细胞亚群，它具有两大特征：免疫抑制和免疫应答低下[4]。其数量减少或功能异常可干扰机体自身免疫耐受机制，导致机体的固有免疫和适应性免疫系统高度活化，从而导致自身免疫性疾病的发生。近年来越来越多的研究证明，Th17/Treg细胞平衡对维持正常免疫应答、防止自身免疫性疾病的发生具有一定的意义。玉屏风颗粒出自危亦林《世医得效方》，亦有说出自朱丹溪《丹溪心法》，由黄芪、白术、防风组成，具有标本兼治、扶正祛邪的功能，是中医扶正固表的经典方剂。玉屏风颗粒通过调节人体特异性免疫和非特异性免疫，具有抗炎、抗应激性、抗变态反应等功效[5]，被称为中药中的“免疫调节剂”。本研究通过比较健康儿童、常规治疗的HSP患儿以及加用玉屏风颗粒治疗的HSP患儿外周血中Th17细胞及其相关因子IL-17、Treg细胞水平的差异和2个治疗组患儿疗效的差异，探讨玉屏风颗粒在调节HSP患儿Th17/Treg细胞失衡及治疗HSP方面的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月—2016年12月在我科住院的50例过敏性紫癜初发患儿，病程1周以内，随机分为常规治疗组和玉屏风组。常规治疗组25例，其中男14例，女11例；平均年龄（6.10±1.82）岁；玉屏风组25例，其中男12例，女13例；平均年龄（6.25±1.74）岁。诊断符合《诸福棠实用儿科学》[6]（第7版）HSP诊断标准：①可触性紫癜；②发病年龄＜20岁；③急性腹痛；④组织切片显示小静脉和小动脉周围有中性粒细胞浸润。4条中符合2条或以上即可诊断。另外选取25例健康体检儿童为健康对照组，男15例，女10例；平均年龄（6.42±1.90）岁。以上各组年龄及性别比较，差异均无统计学意义。本研究符合中国医学伦理委员会制定的伦理标准，并获得我院伦理委员会的批准，均得到受试者家属知情同意。

1.2 治疗方法 2个治疗组患儿入院后均积极寻找并去除致病因素，在控制感染及饮食的基础上，常规治疗组予抗过敏（氯雷他定、西咪替丁、葡萄糖酸钙）、维生素C治疗，视症状短期给予甲基强的松龙片1～2 mg·kg-1·d-1。玉屏风组在常规治疗的基础上加用玉屏风颗粒（国药集团广东环球制药有限公司，批号：国药准字Z10930036，5 g/袋），每次5g，每日2次。疗程均为2周。

1.3 临床疗效评价标准 参照《中医病症诊断疗效标准》[7]中相关标准拟定。临床疗效标准：痊愈：瘀点、瘀斑及出血消失，伴随腹痛、关节痛等症状也消失；显效：症状改善；无效：临床症状无改善。

1.4 标本收集与处理 分别抽取健康对照组、2个治疗组在治疗前及治疗后清晨空腹外周静脉血5 mL：①取2.5 mL于非抗凝管中4℃静置，待血液凝固后，3000 rpm离心5 min，取上层血清于-80℃保存备用；②取2.5 mL置于EDTA抗凝管，以等量的Hanks液稀释后，以Ficoll淋巴细胞分离液行密度梯度离心，分离获取PBMC，用DMEM细胞培养液以2×106/mL的浓度重悬PBMC。

血清白介素-17的检测：采用双抗体ELISA法检测血清中IL-17。ELISA试剂盒购自于西门子公司，严格按照试剂盒说明书要求，对各血清标本进行IL-17的测定。

CD4+CD25+调节性T细胞和Th17细胞的检测：采用流式细胞术检测Treg细胞和Th17细胞。Treg细胞分选试剂盒和Th17细胞分选试剂盒分别购自美国R＆D公司和美国BD公司。严格按照说明书的要求，将分离并重悬的PBMC用荧光素标记的流式抗体进行细胞染色。采用BD公司生产的FACSCanto流式细胞仪检测Treg细胞和Th17细胞亚群，所有数据采用FACSDiva软件进行分析。1.5统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件包对本研究数据进行单因素t检验分析，所有计量数据用均数±标准差（x±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 常规治疗组和玉屏风组临床疗效比较 常规治疗组总有效率为68%，玉屏风组总有效率为96%。2组比较有显著性差异 （P＜0.05）。见表1。

表1 常规治疗组和玉屏风治疗组临床疗效比较 [例(%)]

2.2 2组儿童IL-17、Th17和Treg比较 常规治疗组和玉屏风组患儿外周血Th17细胞数及其相关因子IL-17水平较健康对照组明显增高（均P＜0.05），Treg细胞数较健康对照组明显降低（均P＜0.05），但常规治疗组和玉屏风组患儿Th17、Treg细胞数和IL-17水平比较差异均无统计学意义 （均P＞0.05）。见表2～4。

表3 玉屏风组与健康对照组IL-17、Th17和Treg比较 （x±s）

表3 常规治疗组与玉屏风组IL-17、Th17和Treg比较 （x±s）

2.3 2组患儿治疗前后IL-17、Th17和Treg比较 常规治疗组治疗后Th17细胞数、IL-17水平较治疗前有所下降，Treg细胞数较治疗前有所升高，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。玉屏风组治疗后Th17细胞数、IL-17水平较治疗前和常规治疗组治疗后明显下降（P＜0.05），Treg细胞数较治疗前和常规治疗组治疗后明显增高（P＜0.05）。见表5～7。

表5 常规治疗组治疗前后IL-17、Th17和Treg比较 （x±s）

表6 玉屏风组治疗前后IL-17、Th17和Treg比较 （x±s）

表7 常规治疗组、玉屏风组治疗后IL-17、Th17和Treg比较（x±s）

3 讨论

HSP是一种以全身性小血管炎症为主要病变、可累计多个器官系统的自身免疫性血管炎。HSP的病因复杂，包括感染、免疫紊乱、药物、疫苗接种、遗传等多种因素，但其具体发病机制尚未完全阐明。近年来的研究显示，HSP急性期患儿体内存在体液免疫紊乱、T细胞亚群功能失调及细胞因子分泌异常等多种免疫功能失衡[8]。Th17细胞和Treg细胞是具有相反功能的CD4+T细胞亚群[9]。Th17细胞分泌的IL-17等炎症因子能诱导中性粒细胞的活化，刺激单核/巨噬细胞、成纤维细胞产生多种前炎性细胞因子如IL-6，TNF-α，IL-8和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），以及趋化因子和金属蛋白酶参与机体炎症反应或自身免疫反应[10]。Th17细胞在多种炎症性疾病和自身免疫性疾病的发病中占据重要作用[11]。本研究结果显示，2组HSP患儿治疗前Th17细胞比例、IL-17水平均较健康对照组高增高，与国内外报道一致[12-13]。由此我们可以推测Th17细胞及其特异性细胞因子IL-17参与了HSP的发病，Th17细胞比例及IL-17水平的升高可能是HSP免疫紊乱的主要原因之一。

CD4+CD25+Treg细胞是机体维持自身免疫耐受的重要组成部分，其数量减少或功能障碍可引起自身免疫功能紊乱。近年的研究证实，它在自身免疫性疾病的发病过程中起重要作用[14]。在器官移植的排斥，肿瘤、过敏反应以及慢性感染性疾病等均可以发现CD4+CD25+Treg细胞异常的证据[15-16]。本研究发现，2组HSP患儿治疗前Treg细胞比例较健康对照组明显降低，与Chen[17]研究结果一致。由此推测，Treg细胞同样参与了HSP的发病，而且Treg细胞数量减少可能使其对T细胞的抑制作用减弱，从而导致了机体免疫系统的异常活化，最终导致HSP的发病。因此，Th17/Treg细胞失衡可能是HSP免疫紊乱的重要原因之一。

中医学认为，过敏性紫癜归于“发斑”“血证”等病范畴，乃病邪侵扰机体，损伤脉络，离经之血外溢肌肤黏膜而成。病因以感受外邪、饮食失节、瘀血阻滞、正气不足为主，以风、湿、热、瘀、虚为特点。玉屏风颗粒原方为玉屏风散，是扶正固表的经典方，由黄芪、防风、白术三味中药组成，具有益气、固表、止汗之功效。黄芪为君药，益气固表、补气升阳；白术为臣药，健脾益气；防风为佐药，祛风解表。三药相辅相成，补中有疏，散中有补，健脾益肺，卫邪得除，血癍可止。药理研究，黄芪富含多种氨基酸、叶酸以及铁、锌、锰等微量元素，具有促进机体体液及细胞免疫效应，增强特异性和非特异性免疫功能的作用；白术主要成分为白术醇，含有维生素A，能促进肠壁吸收，还可增加网状内皮系统的吞噬功能；防风具有解热、镇痛、抗炎、抗惊厥的功效。玉屏风颗粒能提高Th1的分化，促进INF-γ释放，INF-γ具有活化巨噬细胞作用，有利于增强细胞免疫功能。玉屏风颗粒可抑制Th2分化，抑制炎症因子释放（IL-4、IL-13），减少肥大细胞脱颗粒，从根本上减少Ⅰ型变态反应的发生，有抗变态反应作用。玉屏风颗粒还能促进B细胞产生IgG、IgM等有效的抗病原体抗体，增强体液免疫功能。本研究发现，玉屏风治疗组疗效明显高于常规治疗组，而且能显著下调HSP患儿Th17细胞及其相关因子IL-17水平，上调Treg细胞水平。这都提示了玉屏风颗粒在调节HSP患儿体内Th17/Treg细胞失衡上有明显的作用。

综上所述，HSP患儿体内存在明显的Th17细胞及其相关因子IL-17水平的升高和Treg细胞 水平的降低。玉屏风颗粒作为一种中药免疫调节剂，能在一定程度上下调HSP患儿Th17细胞及其相关因子IL-17水平，上调Treg细胞水平，显著提高HSP的疗效，故认为玉屏风颗粒是中西医结合治疗HSP的一种有效药物。

[1]吴小川.儿童过敏性紫癜的诊治进展[J].中华实用儿科临床杂志，2013，28（21）：1605-1608.

[2]Okamoto A，Fujio K，Okamura T，et al.Regulatory T-cell-associated cytokines insystemiclupus qerythematosus[J].BiomedBiotechnol，2011:463412.

[3]Han L，Yang J，Wang X，et al.Th17 cells in autoimmune disease[J].Front Med，2015，9(1):10-19.

[4]Zambrano-Zaragoza JF，Romo-Martinez EJ，Duran-Avelar Mde J et al.Th17 cells in auto immune and infectious diseases[J].IntJInflam，2014:651503.

[5]曹继军.玉屏风颗粒的药效学研究[J].中国临床药理学杂志，2010，26(5):390-394.

[6]胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2002：688-690.

[7]国家中医药管理局.中医病证诊断疗效标准[M].南京：南京大学出版社，1994：11-12.

[8]张建江，史佩佩，王淼，等.Th17/Treg失衡及IL-17 TGF-β1水平在儿童过敏性紫癜和紫癜性肾炎中的研究[J].中华肾脏病杂志，2014，30（9）：702-703.

[9]Lo PE，Dieli F，Meraviglia S.Tumor-Infiltrating gammadelta T lymphocytes:pathogenic role，clinical significance ，and differential progaming in the tumor microenvironment[J].Front Immunol，2014(5)：607.

[10]Kimura A，Kishimoto T.IL-6:Regualation of Treg/Th17 balance[J].Eur J Immunol，2010，40(7):1830-1835.

[11]Sarkar S，Cooney LA，Fox DA.The role of T helper type 17 cells in inflammatory arthritis[J].Clin Exp Immunol，2010，159（3）:225-237.

[12]张婷婷，吉晓菲，李少 ，等.过敏性紫癜患儿Th17 Treg细胞及IL-17 IL-23 水平的测定[J].中国免疫学杂志，2016，32（12）：1801-1805.

[13]Li YY，Li CR，Wang GB.et al.Investigation of the change in CD4+T cell subsetinchildrenwith Henoch-Schonle inpurpura[J].RheumatolInt，2012，32（12）：3785-3792.

[14]Grant CR，Liberal R，Mieli-Vergani G，et al.Regulatory T-cells in autoimmune diseases:challenges，controversies and-yet-unanswered questions[J].Autoimmun Rev，2015，14(2):105-116.

[15]RangachariM，KuchrooVK.Using EAE tobetter understand principles of immunefunctionandautoimmunepathology[J].Autoimmun，2013，45（3）:31-39.

[16]UlivieriC，BaldariCT.T-cell-based immunotherapy of auto immunediseases[J].Expert RevVaccines，2013，12(3):297-310.

[17]Chen O，Zhu XB，Ren H，et al.The imbalance of Th17/Treg in Chinese childrenwith Henoch-Schonleinpurpura[J].Int Immunopharmacol，2013，16(1):67-71.

Regulation Effect of Yupingfeng Granule on Th17/Treg Imbalance in Children with Henoch-Schonlein Purpura

DUAN Zhao1,LIN Zhiping2,PENG Yu1,XU Kun1,DENG Yuhong1,WANG Zhi1,LI Lin1
(1.Department of Rheumatology and Immunity,Jiangxi Provincial Children's Hospital,Jiangxi Province,Nanchang 330006,China;2.Department of Gastroenterology,Nanchang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Jiangxi Province,Nanchang 330006,China)

Objective To observe the levels of Th17 cells and associated cytokine IL-17 and Treg cells in peripheral blood in children with Henoch-Schonlein purpura,and to explore the role of Yupingfeng granule to regulate the imbalance of Th17/Treg and its clinical efficacy in children with HSP.Methods Fifty children diagnosed with HSP were randomly divided into routine treatment group and Yupingfeng treatment group.The number of each group is 25 children,and treatment for 2 weeks.Besides,another 25 healthy children in the same age were served as healthy control group.Peripheral vein blood was collected from three groups'children respectively before and after the treatment.Flow cytometry was used to detect proportions of Treg cells and Th17 cells in the peripheral blood.The enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect the level of IL-17.Results The total effective rate of routine treatment group was 68%,and the total effective rate of Yupingfeng treatment group was 96%.There was significant difference between the two groups(P＜0.05).The levels of Th17 cells and IL-17 in routine treatment group and Yupingfeng treatment group were significantly higher than those in healthy control group (all P＜0.05),while the level of Treg cells were lower than those in healthy control group (P＜0.05).However,there was no significant difference in the levels of Th17,Treg cells and IL-17 between the routine treatment group and Yupingfeng treatment group (all P＞0.05).The levels of Th17 cells and IL-17 in routine treatment group after treatment were lower than before,and the levels of Treg cells was higher than before,but there was no significant difference(all P＞0.05).The levels of Th17 cells and IL-17 in Yupingfeng treatment group after treatment were significantly lower than before and those in routine treatment group (all P＜0.05),but the level of Treg cells was higher than before and routine treatment group (all P ＜0.05).Conclusion For HSP children,the levels of Th17 cells and IL-17 increase obviously,while the level of Treg cells decrease obviously.Yupingfeng treatment granule can decrease the levels of Th17 cells and IL-17,and increase the level of Treg cells,thus strengthen the efficacy of HSP.

Yupingfeng granule;Henoch-Schonlein purpura;Th17;Treg;therapy of Chinese patent drug;hematohidrosis

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.21.040

1672-2779（2017）-21-0090-04

2017-08-01）