延边黄牛PRKAG3基因的表达量与肉质性状的相关性分析

孔 琳,严昌国

(延边大学农学院,吉林 延吉 133000)

延边黄牛PRKAG3基因的表达量与肉质性状的相关性分析

孔 琳,严昌国*

(延边大学农学院,吉林 延吉 133000)

实验选取100头6月龄延边黄牛,采用RT-PCR方法检测延边黄牛PRKAG3 基因在不同部位肌肉和不同器官中的表达量差异,进行PRKAG3基因表达量与肉质性状的相关性分析.结果表明:PRKAG3基因在背最长肌的表达量最高,且表达量随着体重的增加而增加,在600 kg时的表达量显著高于300、400、500 kg时的表达量(P<0.05);PRKAG3基因在心脏中的表达量显著高于肝、脾、肺、肾中的表达量(P<0.05);与胴体性状间的相关性分析显示,PRKAG3基因的表达量与屠宰率呈负相关,与眼肌面积和大理石花纹呈正相关,与背膘厚相关性不大;与肉质性状间的相关性分析显示,PRKAG3基因的表达量与pH、亮度、红色度、黄色度呈负相关,与系水力、嫩度、蒸煮损失、彩色度、色相角呈正相关.由此可见,PRKAG3基因可以作为提高肉质性状的候选基因.

延边黄牛;RT-PCR;PRKAG3基因;肉质性状

牛肉风味独特、营养丰富,优质高档牛肉作为牛肉中的精品已经成为人们的消费时尚.对肉牛的育种改良一直是科研人员的工作重点.随着分子遗传学和分子生物技术的不断发展,分子遗传标记及其检测技术在牛的育种过程中高效而精确地选择了目标基因.PRKAG3(The Protein Kinase Adenosine Monophosphate-Activated γ3-subunit)基因是编码一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)调节亚基γ3的基因,主要在骨骼肌中表达[1].Mahlapuu等[2]研究发现,PRKAG3基因是酵解型纤维AMPK的主要异构体,在氧化纤维中的表达量较低,在脑和一些白色脂肪组织中丝毫检测不到.由此可见,PRKAG3基因在机体中的表达模式具有明显的组织特异性,而且在骨骼肌中也具有独特的生理功能.Ciobanu等[3]研究结果显示,Val199-Ile199发生了突变,骨骼肌中的糖原含量会明显降低. PRKAG3基因可能是一个影响肉质性状的主效基因.李梦云等[4]实验结果表明,PRKAG3基因在骨骼肌中的表达量较高,心脏中表达量较少,在肾和肝脏中没有发现此基因的表达.可以推断,PRKAG3基因在骨骼肌中具有独特的生理功能,而且在年龄和品种上具有差异.本研究应用RT-PCR方法检测延边黄牛PRKAG3 基因在不同部位肌肉和不同器官中的表达量差异,对该基因和胴体性状、肉质性状的相关性进行分析,为进一步探讨该基因作为延边黄牛肉质风味候选基因提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择健康、无疾病、体重相近的100头6月龄延边黄牛犊牛(选自吉林省珲春市吉兴牧业),入栏后适应期为15~20 d.实验采用单因素完全随机设计,所有实验用牛严格按照实验设计流程开展饲养直至32月龄屠宰.

1.2 样品采集

1.2.1 活体取样 在体重分别达到300、400、500、600 kg时在背最长肌第12~13肋骨间、深度达5 cm处用活体组织取样钳取样.样品在液氮中冷冻后运回实验室-70℃保存.

1.2.2 血液样品 延边黄牛颈静脉采血10 mL,应用ACD对血液抗凝.ACD∶血液=1∶6,4℃条件下运回实验室,用于血液基因组DNA提取.

1.2.3 组织样品 屠宰后,快速取心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、三角肌、半腱肌、股二头肌、股三头肌、腰大肌、背阔肌样品各3份,并保持每头牛同一组织间取样部位一致.装入消毒的一次性手套中,外包纱布,标记后立即存放在液氮中,然后-70℃保存,用于RNA的提取.

1.3 引物设计与合成 根据基因序列(GenBank:AF214520)、利用软件合成PRKAG3引物.引物由上海博舜联合实验中心合成,各引物序列见表1.根据牛的PRKAG3基因序列(NC_007300.3)设计引物,对延边黄牛PRKAG3基因的CDS区进行PCR扩增,利用Blast比对,在外显子设计引物对延边黄牛PRKAG3基因进行扩增,引物序列如表2.引物合成后为冻干状态,应在离心后加入灭菌的去离子水,制成10 μmol/L的溶液,混匀保存在4℃备用.

1.4 PCR扩增体系与程序 PCR反应体系为20 μL:10XEx Taq Buffer 2.0 μL,2.5 mmol/L dNTP Mix1.6 μL,5p Primer 1 和 5p Primer 2 各 0.8 μL,5U Ex Taq 酶 0.2 μL,ddH2O 13.6 μL.

表1 PRKAG3基因中间片段扩增引物

表2 PRKAG3基因外显子区域引物

在0.5 mL离心管内,依次加入上述各成分,瞬间离心混匀后,立即置于PCR仪中按下列程序进行反应:95℃变性5 min,95℃变性30 s,55℃退火30 s,35个循环,最后72℃延伸10 min.反应结束后,在2%的琼脂糖凝胶板上点样,取PCR扩增产物3.0 mL加入溴酚蓝上样缓冲液2.0 mL,130 V电泳20 min左右,然后在凝胶成像系统上拍照并保存.

1.5 RT-PCR扩增体系与程序 应用从背最长肌中提取的总RNA作为模板进行RT反应,反应总体积为10 μL:5XExscriptTMBuffer 2.0 μL,dNTP Mixtrue(10 mmol/L each)0.5 μL,Oligo dT(2.5 pmol/μL)0.5 μL,ExscriptTMRTase 0.25 μL,Total RNA 5.0 μL,RNase inhibitor 0.25 μL,RNase free dH2O 1.5 μL.在0.5 mL离心管内,依次加入各成分,瞬离混匀,按照42℃15 min,95℃2 min,4℃2 min进行RT反应.完成后立即-20℃保存.

1.6 目的片段与克隆载体的连接 将凝胶回收的目的片段与pMD-18T载体连接.连接反应体系4℃过夜.pMD-18T 载体 0.5 μL,目的片段 4.5 μL,Ligation Buffer 5.0 μL.

1.7 RNA的反转录 向无RNA酶的PCR管中,依次加入 5X PrimeScript Buffer(for Real Time)2.0 μL,Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μL,Oligo dT Primer(50 mol/L)X10.5 μL,Random 6 Mers( 100 mol/L)X1 0.5 μL,Total RNA 500 ng,RNase free ddH2O加至10 μL.反转录程序设置为37℃ 15 min,85℃5 s,4℃Forever.1.8 Real-Time qPCR 检测PRKAG3基因mRNA的表达 向96孔管中,按照以下体系依次加入2XSYBR Mix( 含 4.0 mmol/L Mg2+)7.0 μL,PCR上下游引物(10 μmol/L)各 0.3 μL,ddH2O 3.9 μL,cDNA 1.0 μL.加好样的八连管涡旋振荡,瞬时离心,确保八连管底部无气泡.反应体系:95℃ 3 min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共40个循环,采集荧光信号,Real Time 55℃ 30 s,81个循环,熔解曲线,Melt Time 得到数据后,采用 2-ΔΔCt法计算基因相对表达量,β-actin 为内参.计算公式:

①用内参基因的 Ct 值归一目标基因的 Ct 值:

ΔCt(test)=Ct(target, test)-Ct(ref, test)

ΔC(tcalibrator)=C(ttarget, calibrator)-C(tref,calibrator)

②用校准样本的ΔCt值归一试验样本的ΔCt:

ΔΔCt=ΔCt(test)-ΔCt(calibrator)

③计算表达水平比率:

2-ΔΔCt=表达量的比值

1.9 统计分析 运用SAS的GLM程序,配合模型进行最小二乘分析,进行PGKAG3基因与胴体性状、肉质之间的相关性分析.

2 结果与分析

2.1 延边黄牛PRKAG3基因在不同部位肌肉中的表达量差异 从表3中可以看出,PRKAG3基因在背最长肌中的表达量显著高于其他肌肉的表达量(P<0.05),三角肌、半腱肌、股二头肌、股三头肌、腰大肌和背阔肌间表达量差异不显著(P>0.05).延边黄牛PRKAG3基因在背最长肌中的表达量随着体重的增加而增加,600 kg时的表达量显著高于300、400、500 kg(P<0.05),而300、400、500 kg间表达量差异不显著(P>0.05).PRKAG3基因在心脏中的表达量显著高于肝、脾、肺和肾(P<0.05),在肝、脾、肺和肾间表达量差异不显著(P>0.05).

表3 延边黄牛PGKAG3基因的表达量差异

2.2 延边黄牛PRKAG3基因表达量与胴体性状、肉品质的相关性分析 从表4中可以看出,PRKAG3基因的表达量与屠宰率呈负相关,与眼肌面积和大理石花纹呈正相关,与背膘厚相关性不大.PRKAG3基因的表达量与pH、亮度、红色度、黄色度呈负相关,与系水力、嫩度、蒸煮损失、彩色度、色相角呈正相关.

表4 PGKAG3基因表达量与胴体性状、肉品质的相关性分析

3 讨 论

牛肉肉质是一个综合性状,受诸多外界和内在因素的共同影响.常规的肉质评定是通过测定理化性状等众多数值来客观评定肉质的特性,这些理化指标包括pH、系水力、肌间脂肪含量、嫩度、肉色、蒸煮损失等.然而,这些理化性状的测定存在着一定的系统误差,而且在活体上无法直接进行操作,因此必须花费昂贵的同胞测验才能顺利的完成测定工作,具有较大的局限性.本实验应用DNA分子标记进行辅助选择,有效地避免了这些缺憾.

近些年来,随着候选基因法在动物遗传育种中的应用,可以在DNA水平上对肉质性状的主效基因或者与肉质性状紧密连锁的基因进行控制,在动物的育种选择中使其产肉量和肉质同步提高[5].如何有效地提高延边黄牛肉的品质,已经成为热议的话题[6].多数肉质性状属于数量性状,由多基因控制.这些基因可能是调节基因,也可能是结构基因,或者是在生化代谢过程中影响性状表达的基因.目前,基本确定其功效的有RN基因[7]、MyoD基因和PRKAG3基因.其中,PRKAG3基因是近年来确定的一个影响猪肉肉质的主效基因,在延边黄牛中PRKAG3基因的研究甚少.本研究结果显示,PRKAG3基因表达量随着体重的增加而增加,在600 kg时的表达量显著高于300、400、500 kg时的表达量;PRKAG3基因不仅在背最长肌中表达量较高,而且在心脏中的表达量也较高,在肝、脾、肺、肾及其他肌肉中表达量相对较少,是否与心脏的某些代偿功能相关还有待于进一步研究.Lindahl等[8]报道,PRKAG3基因对猪肉最终的pH、色度等性状存在一定的影响.Plastow[9]研究发现,PRKAG3基因对不同猪肉pH、亮度、红度、黄度值均存在不同程度的影响.本研究发现,PRKAG3-6位点的多态性与延边黄牛的pH有一定的相关性.以上研究表明,PRKAG3基因可以影响猪的pH,对牛肉的pH也有一定的影响.本研究中延边黄牛均来自同一牧场且饲养环境和条件均相同,避免了牧场效应和环境因素对实验结果的影响.

[1] Viollet B, Mounier R, Leclerc J, et al. Targeting AMP‐activated protein kinase as a novel therapeutic approach for the treatment of metabolic disorders[J]. Diabetes Metab,2012, 6:33‐35.

[2] Mahlapuu M, Johansson C, Lindgren K, et al. Expression profiling of the gamma‐subunit isoforms of AMP‐activated protein kinase suggests a major role for gamma3 in white skeletal muscle[J]. Am J Physiol‐ Endoc M, 2003, (2):194‐200.

[3] Ciobanu M, Huang K T, Daguer J, et al. Selection of a synthetic glycan oligomer from a library of DNA‐templated fragments against DC‐SIGN and inhibition of HIV gp120 binding to dendritic cells[J]. Chem Commun, 2011, 33:34‐37.

[4] 李梦云, 陈代文, 张克英. PRKAG3基因在骨骼肌中的营养代谢调节作用及其对肉质的影响[J]. 动物营养学报,2006, (2):33‐35.

[5] 刘嫣然. 秦川肉牛FGF2基因多态性及与生长性状的相关性分析[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2016:38‐40.

[6] 董梦宇. GHRL及其受体GHSR基因的多态性与秦川肉牛体尺性状的关联性分析[D]. 杨凌:西北农林科技大学,2016.

[7] Le Roy P, Elsen J M, Caritez J C, et al. Comparison between the three porcine RN genotypes for growth, carcass composition and meat quality traits[J]. Genet Sel Evol,2000, 32:165.

[8] Lindahl G. Colour stability of steaks from large beef cuts aged under vacuum or high oxygen modified atmosphere[J].Meat Sci, 2010, 87:28‐35.

[9] Zhang C Y, Wang Z, Bruce H L. Associations between single nucleotide polymorphisms in 33 candidate genes and meat quality traits in commercial pigs[J]. Anim Genet,2014, 45(4):508.

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-048

2016-08-25;

2017-06-14

延边黄牛高档牛肉生产与脂肪沉积规律研究;吉林省科技厅国际合作处(20130413036GH)

孔琳(1983-),女,吉林延吉人,博士研究生,研究方向为动物遗传育种与繁殖, E-mail:konglin777@126.com

*通讯作者:严昌国(1960-),男,朝鲜族,博士,教授,主要从事反刍动物营养研究及延边黄牛研究,E-mail:ycg@ybu.edu.cn