UPLC 法测定大鼠血浆中那格列奈的浓度及药动学研究Δ

王凯，蒋大鹏，张伟，王淑梅（河北医科大学第二医院药学部，石家庄050000）

UPLC 法测定大鼠血浆中那格列奈的浓度及药动学研究Δ

王凯＊，蒋大鹏，张伟，王淑梅#（河北医科大学第二医院药学部，石家庄050000）

目的：建立测定大鼠血浆中那格列奈浓度的方法，并研究其在大鼠体内的药动学特征。方法：采用超高效液相色谱法（UPLC）。色谱柱为Acquity UPLC®BEH C18，流动相为乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钾缓冲盐溶液（41∶59，V/V），流速为0.38 mL/min，柱温为35℃，检测波长为210 nm，进样量为2 μL。18只Wistar大鼠分别ig那格列奈16 mg/kg，分别于给药前及给药后10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min于眼内眦取血0.4 mL，测定血浆中那格列奈的浓度；并采用DAS 2.1.1软件计算那格列奈药动学参数。结果：那格列奈质量浓度在0.05～6.4 μg/mL范围内线性关系良好（r＝0.999 3），定量下限为0.05 μg/mL；日内（n＝5）、日间（n＝3）精密度和稳定性（n＝3）试验的RSD均小于10%；提取回收率和方法回收率分别为78.71%～80.56%、91.78%～100.42%（RSD＜10%，n＝5）。大鼠ig那格列奈后，AUC0-8h为（5.87±2.32）μg·h/mL，AUC0-∞为（6.11±2.48）μg·h/mL，t1/2为（1.72±0.55）h，tmax为（0.67±0.29）h，cmax为（3.34±1.23）μg/mL。结论：该方法准确快速、专属性强，可用于大鼠体内那格列奈浓度的测定；那格列奈在大鼠体内吸收迅速、代谢较快。

那格列奈；超高效液相色谱法；药动学；大鼠

那格列奈（Nateglinide）是用于治疗2型糖尿病的非磺酰脲类口服降糖主流药物之一[1]，可根据血液中葡萄糖水平调节胰岛素分泌，改善胰岛素初相分泌及糖化血红蛋白水平。该药具有起效快、作用时间短、组织选择性高、与心肌和骨骼肌亲和力低、不易引起低血糖反应等特点，能有效控制餐后血糖水平[2-3]；其安全性和有效性在2型糖尿病患者中得到验证[4]，并被《中国2型糖尿病防治指南》推荐使用[5]。

由于那格列奈仅在210 nm波长左右有吸收峰[6]，故其检测易受血浆内源性物质干扰。目前，国内外的研究多采用固相萃取联合高效液相色谱法（HPLC）或高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）测定血浆中那格列奈的浓度[7-10]，以减少杂质对其测定的干扰。但由于这些方法存在分析时间长、样品处理方法烦琐、成本较高等缺点，在实际应用中受到了很大限制。本研究拟采用液-液萃取联合超高效液相色谱（UPLC）法，通过优化色谱条件，建立快速、可大批量测定大鼠血浆中那格列奈浓度的方法，并测定大鼠灌胃给予那格列奈后的经时血药浓度，研究其在大鼠体内的药动学，为其临床血药浓度监测提供新的方法学参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters AcQuity UPLC系统，包括恒温自动进样器、四元梯度泵、紫外检测器、柱温箱和Waters Empower 3操作平台（美国Waters公司）；CPA 225D分析天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 药品与试剂

那格列奈对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100619-200501，纯度：99.5%）；那格列奈片（江苏德源药业有限公司，批号：13101052，规格：每片0.12 g）；格列齐特对照品（内标，中国食品药品检定研究院，批号：100269-201505，纯度：99.5%）；乙腈、磷酸、磷酸二氢钾、甲酸均为色谱纯，乙醚、乙酸乙酯均为分析醇，水为蒸馏水。

1.3 动物

健康Wistar大鼠18只，♂，体质量220～240 g，购自河北省动物实验中心，动物生产许可证号：SCXK（冀）-2013-1-003。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC®BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钾缓冲盐溶液（41∶59，V/V，磷酸调节pH至4.25）；流速：0.38 mL/min；柱温：35℃；检测波长：210 nm；进样量：2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 那格列奈系列对照品溶液的制备精密称取那格列奈对照品10 mg，置于10 mL量瓶中，用41%乙腈溶液溶解、定容，制成质量浓度为1 mg/mL的对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液适量于量瓶中，用41%乙腈溶液制成质量浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL的系列对照品溶液，4℃保存，待用。

2.2.2 内标标准工作液的制备精密称取格列齐特对照品10 mg，置于10 mL量瓶中，用41%乙腈溶液溶解、定容，制成质量浓度为1 mg/mL的内标贮备液。精密量取内标贮备液适量于量瓶中，用41%乙腈溶液制成质量浓度为20 μg/mL的标准工作液，4℃保存，待用。

2.3 血浆样品的处理

取血浆样品，室温下解冻后，离心（离心半径为6 cm、10 900 r/min，下同）2 min。取上清液200 μL于5 mL离心管中，加入内标标准工作液20 μL、6‰甲酸溶液100 μL，涡旋30 s后加入乙醚-乙酸乙酯（70∶30，V/V）混合液1.5 mL，再涡旋2 min，离心3 min。取上清液于另一5 mL离心管中，40℃氮气流下吹干后，用100 μL的41%乙腈溶液复溶，吸取2 μL进样测定。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性取那格列奈对照品溶液（8 μg/mL）、内标标准工作液进样；另取空白血浆和给药后1 h大鼠血浆，分别按“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，在该色谱条件下，那格列奈、格列齐特峰形良好，保留时间分别为3.29、2.27 min；大鼠血浆中内源性物质对测定无干扰，各峰间分离度均大于1.5，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig1 HPLC chromatograms

2.4.2 标准曲线与定量下限取那格列奈系列对照品溶液各20 μL，置于40℃氮气流下吹干，再分别加入空白血浆200 μL，制成质量浓度浓度分别为6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 μg/mL的系列那格列奈血浆样品，按“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以那格列奈质量浓度为横坐标（x）、那格列奈与内标格列齐特的峰面积的比值为纵坐标（y）进行线性回归，得回归方程为y＝0.718 6x－0.004 1（r＝0.999 3）。结果表明，那格列奈在质量浓度为0.05～6.4 μg/mL范围内线性关系良好，定量下限为0.05 μg/mL。

2.4.3 准确度、提取回收率与精密度分别制备低、中、高质量浓度（0.1、0.8、5.8 μg/mL）血浆样品，各5份，按“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录那格列奈峰面积Ai，根据标准曲线方程计算方法回收率。取等量对照品直接进样测定，记录峰面积Bi，则提取回收率（%）＝Ai/Bi×100%。按上述方法分别制备低、中、高浓度血浆样品各5份，按“2.3”项下方法处理后，日内连续进样5次，连续进样3 d，分别考察日内、日间精密度。结果，方法回收率为91.78%～100.42%（RSD＜10%，n＝5），提取回收率为78.71%～80.56%（RSD＜10%，n＝5），日内（n＝5）、日间（n＝3）精密度试验的RSD均小于10%。

2.4.4 稳定性取“2.4.3”项下低、中、高质量浓度血浆样品，分别于室温放置12 h、4℃进样器内放置24 h、－40℃冷冻保存15 d、反复冻融3次，均平行3份，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，上述各条件下稳定性试验的RSD均小于10%（n＝3），表明样品在上述条件下稳定性良好。

2.5 药动学研究

将那格列奈片研成粉末，精密称取粉末196.8 mg（相当于那格列奈40 mg），加入3‰羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液10 mL，制成质量浓度约为4 mg/mL的那格列奈混悬液。取18只Wistar大鼠，禁食不禁水12 h后，ig那格列奈混悬液16 mg/kg（给药剂量根据体表面积法确定，为人用量的7倍）。分别于给药前及给药后10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min自眼内眦取血0.4 mL（自给药120 min后，大鼠每次取血后均ig 0.4 mL生理盐水补充体液），置于肝素化的1.5 mL离心管中，离心5 min，取上层血浆于离心管中，置于－40℃冰箱中保存，待测。动物实验结束后，将待测血浆样品于室温下自然解冻，按“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，绘制血药浓度-时间曲线。那格列奈在大鼠体内的药-时曲线见图2。

图2 那格列奈在大鼠体内的药-时曲线Fig2 Plasma concentration-time curve of nateglinide in rats in vivo

采用DAS 2.1.1药动学软件计算主要药动学参数。结果，那格列奈在大鼠体内的AUC0-8h为（5.87±2.32）μg·h/mL，AUC0-∞为（6.11±2.48）μg·h/mL，t1/2为（1.72±0.55）h，tmax为（0.67±0.29）h，cmax为（3.34±1.23）μg/mL，CL为（3.17±1.69）L/（h·kg），V为（7.32±3.05）L/kg。

3 讨论

在血浆样品处理方法的筛选中，笔者尝试了蛋白沉淀法和液-液萃取法。虽然蛋白沉淀法操作简便，但杂质过多，而且处理后的样品浓度会被稀释，不利于检测；采用乙酸乙酯进行提取，其灵敏度较低，难以满足测定要求。刘茜等[11]采用乙醚作提取剂，提取回收率仅能达到60%左右；刘亮[12]采用异丙醇-二氯甲烷（80∶20，V/V）作提取剂，提取剂的使用量为3 mL。参阅上述文献，经多次优化后，最终确定提取剂为乙醚-乙酸乙酯（70∶30，V/V）混合液。为了提高提取回收率，根据相似相溶原理，当化合物以分子形式存在时，更易溶于乙醚或乙酸乙酯。且陈毅挺等[13]研究表明，当pH小于2.5时，那格列奈基本以分子形式存在。故在加入提取剂前在血浆中加入6‰的甲酸溶液100 μL后，仅需要提取剂1.5 mL即可使提取回收率提高到80%左右。因此，与文献报道的其他方法相比，该方法既提高了工作效率，又降低了成本。

在流动相选择方面，为得到良好的峰形和较高的响应值，试验中曾采用不同比例的乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液作为流动相，但峰形均不理想。参阅文献[8]，选用10 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液为水相，并用磷酸调节pH值。经多次优化筛选后，最终将流动相确定为乙腈-磷酸二氢钾缓冲液（41∶59，V/V，磷酸调pH至4.25）。在内标选择方面，笔者曾尝试选用瑞格列奈，但在选定的色谱条件下其出峰时间与杂质重叠，测定受干扰；选用布洛芬作为内标，在选定的色谱条件下其保留时间较长（大于5 min）；而用格列齐特作为内标，保留时间适宜，与那格列奈分离完全，且峰形良好，无内源性物质干扰。

药动学结果显示，那格列奈口服吸收迅速、代谢较快，tmax为（0.67±0.29）h，t1/2为（1.72±0.51）h，这与文献[11]报道基本一致。

综上所述，本研究采用液-液萃取联合UPLC法测定大鼠体内那格列奈浓度，操作简便、分析时间短，可应用于大样本的大鼠血浆中那格列奈浓度测定和药动学研究，为今后人体内那格列奈与其他药物的相互作用研究提供了方法学参考。

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Concentration Determination of Nateglinide in Rats’Plasma by UPLC and Study on Its Pharmacokinetics

WANG Kai，JIANG Dapeng，ZHANG Wei，WANG Shumei（Dept.of Pharmacy，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of nateglinide in rats’plasma and study its pharmacokinetic characteristics in rats in vivo.METHODS：UPLC was performed on the column of Acquity UPLC®BEH C18with mobile phase of acetonitrile-10 mmol/L potassium dihydrogen phosphate buffer（41∶59，V/V）at flow rate of 0.38 mL/min，with column temperature of 35℃，detection wavelength of 210 nm and volume of 2 μL.18 Wister rats were intragastrically administrated nateglinide 16 mg/kg.Blood sample 0.4 mL was taken from medial canthus before administration and after 10，20，30，45，60，90，120，180，240，360，480 min of administration.The concentration of nateglinide in rats’plasma was determined；then DAS 2.1.1 software was used to calculate its pharmacokinetic parameters.RESULTS：Nateglinide showed good linear relationship in 0.05-6.4 μg/mL（r＝0.999 3），lower limit of quantification was 0.05 μg/mL；RSDs of inter-day（n＝5），intra-day（n＝3）and stability（n＝3）tests were lower than 10%；extraction recovery rate and method recovery rate were 78.71%-80.56%，91.78%-100.42%（RSD＜10%，n＝5），respectively.After rats were intragastrically administrated nateglinide，AUC0-8hwas（5.87±2.32）μg·h/mL，AUC0-∞was（6.11±2.48）μg·h/mL，t1/2was（1.72±0.55）h，tmaxwas（0.67±0.29）h and cmaxwas（3.34±1.23）μg/mL.CONCLUSIONS：The method is accurate，rapid with strong specificity，and can be used for the concentration determination of nateglinide in rats in vivo；nateglinide is absorbed and metabolized quickly in rats in vivo.

Nateglinide；UPLC；Pharmacokinetics；Rats

R917

A

1001-0408（2017）31-4381-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.16

河北省药学会2015年度临床药学专项科研项目（No.YX201505）

＊硕士研究生。研究方向：体内药物分析。电话：0311-66003762。E-mail：691158182@qq.com

#通信作者：主任药师，硕士生导师。研究方向：体内药物分析和药物相互作用。电话：0311-66002089。E-mail：shumei-wang@163.com

2016-12-26

2017-09-12）

（编辑：刘明伟）