HPLC定量指纹图谱法评价黄藤质量研究

王 雪 赵昱玮 南敏伦 赫玉芳 吕 娜 何忠梅▲

1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；2.吉林省中医药科学院植物化学研究所，吉林长春 130012

HPLC定量指纹图谱法评价黄藤质量研究

王 雪1赵昱玮2南敏伦2赫玉芳2吕 娜1何忠梅1▲

1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；2.吉林省中医药科学院植物化学研究所，吉林长春 130012

目的 本实验采用Agilent 1220高效液相色谱法建立黄藤的指纹图谱，并建立了同时测定盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱含量的方法。 方法 采用ACE C18（4.6mm×250mm，5µm）色谱柱，0.1%磷酸溶液（每100mL中加入0.1g十二烷基硫酸钠）（A）-乙腈（B）为流动相梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长345nm。 结果 建立了黄藤的HPLC定量指纹图谱，10批药材的HPLC指纹图谱共标定12个共有峰，相似度均在0.90以上。 结论 该方法建立的黄藤HPLC指纹图谱特征性强﹑重复性好﹑灵敏度高，为黄藤的鉴定及质量控制提供了参考价值。

黄藤；指纹图谱；盐酸巴马汀；盐酸药根碱

黄 藤 为 防 己 科（Menispermaceae） 黄 藤（Fibraurea recisa Pierre.）的干燥藤茎，又名天仙藤﹑土黄连等，主要分布在我国广东﹑云南﹑广西等地。具有泻火通便﹑清热解毒的功效[1]，其主要化学成分为生物碱﹑内酯等[2]，现代药理作用表明黄藤的活性成分黄藤素具有显著的抗炎﹑抑菌等活性[3]。目前，鲜见报道有关于黄藤药材的HPLC指纹图谱的研究，为了控制黄藤药材的质量，从而进行黄藤药材的HPLC指纹图谱研究。因此本研究旨在对不同产地的黄藤HPLC指纹图谱进行建立，防止其伪品混入市场[4]，通过黄藤定量HPLC指纹图谱的建立来进行药材的质量分析，以期能更为全面地控制该药材的质量，为其质量评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1220高效液相色谱仪（Agilent）；KQ-100型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海精密仪器仪表有限公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（西安禾普生物科技有限公司）；124S电子天平（sartorius）。

1.2 试药

乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱（纯度≥98%，批号分别为：0732-200005﹑110733-201007，中国食品药品检定研究院）。10批黄藤药材分别采自各个产地，经鉴定为防己科黄藤（Fibraurea recisa Pierre.）的干燥藤茎。10批药材均在2014年购买于各当地的药材市场，其来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent 1220液相色谱仪（美国Agilent 公司）；ACE C18（4.6mm×250mm，5µm）色 谱 柱；进 样量：10µL；柱温：30℃；检测波长：345nm；流动相：0.1%磷酸溶液（每100mL中加入0.1g十二烷基硫酸钠）（A）-乙腈（B），流速：1.0mL/min，梯度 洗 脱：0～ 10min，80% ～ 75%A；10～ 20min，75% ～ 70%A；20 ～ 30min，70% ～ 60%A；30 ～ 50min，60% ～ 55%A；50 ～ 60min，55% ～ 45%A；60 ～ 75min，45% ～ 35%A；75 ～ 80min，35% ～ 30%A；80 ～ 85min，30% ～ 20%A；85 ～ 90min，20% ～ 10%A；90～ 100min，10% ～ 80%A。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱对照品适量，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为4.12mg/mL﹑1.02mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

称取样品粉末0.1g，精密称定，置50mL容量瓶中，加入1%盐酸甲醇约40mL，超声提取30min，放冷，用1%盐酸甲醇定容至刻度，滤过，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品（S10）溶液，按照上述色谱条件，连续进样测定6次，计算色谱峰及相对保留时间RSD值，实验结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取药材样品（S10），制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算色谱峰及相对保留时间的RSD值，结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.0%，表明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品（S10）溶液，分别于 0，2，4，6，8，12h 按照上述色谱条件进行测定，结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.0%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.5 黄藤指纹图谱的建立与评价

2.5.1 样品测定 取10个不同产地黄藤药材样品，制备供试品溶液，按照上述色谱条件进样测定。2.5.2 黄藤指纹图谱的建立 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对10批黄藤药材HPLC图谱进行结果分析，共确定12个共有峰，结合保留时间指认了其中两个色谱峰：峰6为药根碱，峰8为巴马汀。因巴马汀的色谱峰峰面积较大，保留时间稳定，故选择其为对照峰（即S峰），对照图谱见图1。

图1 黄藤药材HPLC对照指纹图谱（示共有峰）峰6：药根碱 峰8：巴马汀

2.5.3 黄藤药材的指纹图谱相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对S1-S10号黄藤药材指纹图谱进行叠加，并以S10为对照标准，进行相似度评价。结果表明，10批黄藤药材的相似度均在0.90以上，表明各个产地的黄藤均有较高的相似度，质量较稳定，只是在个别产地的黄藤上有细微差别。结果见图2﹑表1。

图2 不同产地黄藤药材HPLC指纹图谱

表1 10批黄藤药材产地及相似度

3 黄藤中生物碱类化合物的含量测定

3.1 线性关系考察

精密量取“2.2”项中混合对照品溶液0.1﹑0.2﹑0.5﹑1.0﹑2.0mL分别置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件测定，以各对照品的质量浓度为横坐标﹑峰面积为纵坐标，计算得线性方程，结果见表2，表明各对照品在相应质量浓度范围内线性关系良好。

表2 对照品的线性方程

表3 黄藤药材中盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱的加样回收试验

3.2 稳定性试验

取同一供试品（S10）溶液，分别于 0﹑2﹑4﹑6﹑8﹑12h按照上述色谱条件进行测定，结果盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱的RSD分别为0.6%，1.1%。

3.3 精密度试验

取同一供试品（S10）溶液，按照上述色谱条件连续进样6次，结果盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱含量的RSD分别为0.8%，1.0%。

3.4 重复性试验

取供试品（S10）制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，结果盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱的含量的RSD分别0.8%，1.3%。

3.5 加样回收率试验

取已知含量的同一批黄藤药材（S2）6份各约0.1g，精密称定，分别加入盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱，制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，进行回收率考察，盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱平均回收率结果见表3。

3.6 含量测定

分别取10批黄藤药材粉末约0.1g，精密称定，制备供试品溶液，按上述色谱条件分析，计算10批样品中3种成分的含量，结果见表4。

表4 10批黄藤药材中盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱的含量测定

4 讨论

本实验对黄藤药材的提取溶剂进行考察，分别比较了甲醇﹑1%盐酸甲醇和2%盐酸甲醇﹑70%乙醇作为提取溶剂，以回流提取﹑超声提取作为提取方法进行了考察，同时对提取的时间也进行考察，结果表明，以1%盐酸甲醇超声提取30min的样品，色谱峰个数较多，峰面积较大，分离度能达到要求，故此作为提取方法[5-7]。

本试验分别对乙腈-水﹑乙腈-磷酸溶液﹑甲醇-水及甲醇-磷酸溶液等流动相进行了考察，最终确定乙腈-0.1%磷酸溶液（每100mL中加入0.1g十二烷基硫酸钠）为流动相的梯度洗脱系统。分别对ACE C18﹑DM C18进行了耐用性考察，从中选定了ACE C18（4.6mm×250mm，5µm），该色谱柱对黄藤药材有较好的分离效果[8-11]。

指纹图谱的建立，具有其每个峰具体为何种物质尚不明确，却能给出可靠而又充分的信息，对药材的质量进行控制的优势。本实验通过对10批不同产地黄藤的指纹图谱进行分析，各黄藤药材指纹图谱间具有较高的相似程度，相似度均在0.90以上，并标定了12个共有峰，较好的反映了黄藤药材的整体性和特异性。各色谱峰的保留时间匹配较好，说明黄藤化学成分类型较为一致，但各成分的含量差异较大。利用指纹图谱相似度评价的差异，可控制药材对成品的影响[12-15]。

本文利用HPLC法建立了黄藤药材的指纹图谱，同时测定黄藤中盐酸巴马汀﹑盐酸药根碱的含量，并进行了相似性分析，系统而又全面的反映了中药黄藤有效成分信息，本试验方法简便﹑易行﹑可靠，为综合评价黄藤药材质量提供了参考依据。同时，中药指纹图谱对于黄藤药材及其方剂的生产和研发中也有着较为广阔的应用前景。

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Full-quantified hplc fingerprint for quality evaluation of fibraurea recisa pierre

WANG Xue ZHAO Yuwei NAN Minlun HE Yufang LV Na HE Zhongmei
1.College of Chinese Medicinal Herbs, Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China; 2.Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province, Changchun 130012,China

Objective The experiment adopted Agilent 1220 HPLC to establish the fingerprint of Fibraurea recisa Pierre, and establish the way that simultaneously determined the content of palmatine hydrochloride and jatrorrhizine hydrochloride. Methods The analytical column was ACE C18(4.6mm×250mm,5µm).The mobile phase was acetonitrile-water(containing 0.1% phosphoric acid and 0.1% sodium dodecyl sulfate) with gradient elution,and the detection wavelength was set at 345nm.The flow rate was 1.0mL/min,and the column temperature was set at 30℃.Results The HPLC ration fingerprint of Fibraurea recisa Pierre was established.12 common peaks were defined among the 10 batches in the HPLC fingerprint, and the similarity is above 0.90. Conclusion The fingerprint of Fibraurea recisa Pierre that the method has strong features, repeatability and high sensitivity,which provides reference value for the identification and the quality control of Fibraurea recisa Pierre.

Fibraurea recisa Pierre; Full-quantified fingerprint; Palmatine hydrochloride; Jatrorrhizine hydrochloride

R927.2

A < class="emphasis_bold"> [文章编号]]

] 2095-0616（2017）21-40-04122211

▲通讯作者

2017-06-15）