2016年朝阳区动物诊疗机构人畜共患病流行病学调查报告

王雅琴 张海云 唐艳荣 杨 荣 张晓梅 许东保 张长林 曹院章

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京100018）

2016年朝阳区动物诊疗机构人畜共患病流行病学调查报告

王雅琴 张海云*唐艳荣 杨 荣 张晓梅 许东保 张长林 曹院章

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京100018）

本文对动物诊疗机构中因不同的原因前来就诊的宠物进行采样，调查其可能的人畜共患病的携带情况。通过动物诊疗机构共计采样286份，应用 V8实时快速荧光PCR检测设备，进行布鲁氏菌病、钩端螺旋体病、弓形体病的快速检测；其中布鲁氏菌病未检出；弓形体病检测出阳性占比8.2%；钩端螺旋体病阳性占比3.6%；

流行病学调查 就诊宠物犬 布鲁氏菌病 钩端螺旋体病 弓形体病 实时荧光PCR检测

0 引言

城市生活中，宠物的饲养既是一种精神需求，也是一种生活方式。在人们关注身心健康的同时，不可避免的重视所饲养动物可能引发的人畜共患传染病的可能。

所以本次调研项目，旨在通过定点诊疗机构中的就诊病例，采集样品，开展涉及布鲁氏菌病、弓形体病、钩端螺旋体病的实时荧光PCR检测。调查临床病例中可能携带的人畜共患病比例。通过现场调查与实验室检测相结合的方式，动物疫病进行定期定点抽样调查，经对各类资料和数据综合分析、有效评估免疫效果、病原污染程度等技术指标，从而提出防控建议和预测预警。提高宠物饲养带来的健康危害、经济损失以及潜在的风险意识。

本项目的流行病学调查方法采取动物疫病定点流调的方法，结合实验室检测相结合的方式，在朝阳区四个街道中的动物诊疗机构中开展采样，样品采集的时间为2016年1月至12月，样品冷链运输到我中心实验室，进行V8实时荧光PCR检测，相关数据处理。

本项目的实施单位为北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，参加采样的单位分别位于朝阳区南磨房街道、团结湖街道、望京街道、奥运村街道中的动物治疗机构共计四家。同时涉及朝阳区警犬巡防队的警用犬只。

1 材料和方法

1.1 定点调查的原则和范围

1.1.1 定点流调的原则：每个定点的布局考虑到地域、交通、动物饲养量、动物诊疗机构的工作能力以及所采样品充分的代表性。

1.1.2 定点的范围：指针对动物诊疗机构中前来就诊的宠物采样。

1.2 定点调查的内容

（1）开展项目的动物诊疗机构的完整信息调研。

（2）开展宠物样品信息采集，内容包括宠物主人姓名、病例号、宠物年龄、性别、品种、就诊时临床症状、采集样品种类，采样日期。

（3）开展V8实时快速荧光PCR检测，配套专用商品化试剂盒，对布鲁氏菌病、钩端螺旋体病、弓形体病进行快速诊断。

2 定点流行病学调查情况

2.1 样品采集及运输要求

2.1.1 采集样品种类：EDTA血液采集使用专用的“一次性使用人体静脉血样采集容器EDTA K2”生产日期：160406；失效日期：201803。

2.1.2 样品保存：样品的适当保存是有效检测的关键环节。样品如果在三日内完成检测，均可以再4℃冷藏保存，超过3日再做检测的样品，可于-20℃冷冻保存。血液类样品，于-20℃冷冻保存。

2.1.3 样品运输：样品要求保持冷链运输，是保证基因检测样品时效性的重要措施。所有样品均需要低温运输，使用样品运输箱，内部放置冰块或者干冰。

2.1.4 样品采集标准：EDTA血液样品采集：选择临床患病动物表现为呼吸困难、黄染、眼葡萄球膜炎症的、生殖系统疾病、神经系统、骨关节问题、老年性肝肾功能异常的；血液样品量不得少于2ml。

2.2 试验方法和试剂来源

2.2.1 检测原理：实时荧光PCR检测方法是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过特定探针和引物的设计和合成，模板的制备，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。原则上将凡是已知有特异标记的病原体都可用PCR进行鉴定。可用PCR检测的病原体包括各种细菌、病毒、衣原体、支原体、寄生虫等。

2.2.2 实验使用仪器：

（1）V8实时荧光PCR检测仪器。特点：快速变温、收集荧光信号、自动设定阈值、自动计算Ct值。

（2）移液器。试验中配备的eppendorf手动单道移液器10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl的移液器各一把。

（3）高速离心机。配备Eppendorf 高速离心机5418一台。

（4）其他设备：配备电热恒温水浴锅一台、小型漩涡振荡器一台，计时器一台，板架若干。

（5）实验使用的V8反应试剂盒。共计引进V8试剂盒92个，其中布鲁氏菌病V8反应试剂盒30个，钩端螺旋体病V8反应试剂盒32个，弓形虫病V8反应试剂盒30个。

3 检测方法V8实时荧光PCR检测操作步骤

3.1 DNA提取操作

3.1.1 消化：反应体系中存有200μl消化液，加入经过充分融化、震荡混匀的样品100μl，加入20μl蛋白酶k，震荡混匀。于56℃水浴十分钟，每三分钟振荡一次。降到室温后，加入300μl结合液。

3.1.2 吸附：充分混匀后的反应液，静置3～5min，加入吸附柱中，10000 rpm、30 s中离心。

3.1.3 洗涤：加入洗涤液500μl于吸附柱中，10000 rpm、30 s中离心。弃去收集管内液体，重复操作。弃去液体后，10000 rpm、120 s。

3.1.4 洗脱：加入洗脱液50μl，10000 rpm、30 s离心，获得相应的核酸模板。

3.2 核酸扩增反应操作

（1）取V8实时荧光PCR反应管，置于室温融化，放置于反应管架（温度保持在2℃～10℃），用移液器吸取核酸模板R（D）NA5μl加入反应管中，用离心机离心30 s，放入V8实时荧光PCR检测仪器中，使用对应的反应程序进行扩增检测

（2）结果判定：根据自动分析，Ct值≤36并出现特定的扩增曲线为阳性样品；Ct值>36时，并出现特定的扩增曲线，需要重新取样品提取核酸模板，扩增后进行结果判定，如仍出现特定的扩增曲线，结果判定为阳性样品；对于未能呈现特定的“s”型曲线的，即使Ct值≤36，应为阴性。

3.3 注意事项

3.3.1 预防污染

操作人员必须穿戴好工作服、口罩、手套；

提取过程中，尽量避免手套接触吸附柱管口和离心管管口；

将液体吸入吸附柱中时，若离心管开盖时液体粘在手上或溅出，应立即更换手套；

所有用于检测的废弃物都应该收集放入消毒液的消毒缸中。

反应管放入仪器前，一定要盖紧封口，放置在仪器内崩开。实验结束后，用卡夹取出时，要卡到反应管最后一道棱框内，放置取出过程中导致封口崩开，飞沫污染仪器。

实验结束后，应该用1%次氯酸钠或75%酒精消毒工作台。

3.3.2 规范操作

所有样品必须进行明确的标记，编号，采样单位制作完整的《V8项目检测样品采样表格》，送样品时上交《V8项目流行病学调查采样登记表》。由实验室进行检测号码的编制，并且进行标记，排序。

所有样品都需进行充分的融化后进行检测，棉拭子以及唾液样品检测前需要进行振荡混匀。严禁样品反复冻融（三次不可用）。

实际操作中，所有试剂使用前需要认真核对检测试剂名称。反应管、蛋白酶K使用前，于室温融化，随用随取，用后立即放回冰箱。

所有实验操作完全按照操作说明书步骤操作，不得删减。

3.4 仪器设备计量、效验、维护

参加由北京世纪元亨组织的V8快速实时荧光PCR能力验证比对实验，依据ISO/IEC17043、GB/T27043和SN/T2989运作能力验证计划，参与能力验证比对实验。实验结果：比对实验中的四个盲样，检测结果均为满意。计算中位值、标准IQR和Z比分数，均为满意。

3.5 影响调查研究结果和数据的条件和因素

3.5.1 样品采集的代表性意义：动物流行病学调查采样工作，采样人员的主观因素影响比较严重，随机性差，不具有完全的代表性。同时，也与动物诊疗机构工作状况相关，在日常工作比较繁忙的季节，采样数量明显较少。存在样品采集的随机误差和选择偏倚。

3.5.2 检测水平和检测方法效验误差：V8实时荧光PCR检测系统虽然是成熟的检测技术，但是在实际操作过程中，对操作人员的要求较高，对各种试剂的存储、使用都有着极为苛刻的规定，不可避免出现人员误差和仪器误差。

3.5.3 项目设计中的目的性偏倚：本项目的主旨是宠物源性人畜共患病的快速诊断检测的应用，针对个体动物的疫病携带情况的检测和分析，缺少对整个群体的大数据分析和考量。所以，检测范围小、采集样品量少、实验数据少，社会意义有限。

4 结果

2016年1 月至12月期间我实验室共计接收到动物诊疗机构送检EDTA血液样品286份。共计开展实时荧光PCR检测829项次，其中弓形虫检测279份、布鲁氏菌病检测275份、钩端螺旋体病检测275份。

4.1 弓形虫调查结果

共计收集EDTA犬血液样品286份，其中279份符合实验要求，检出结果为共计检出23份阳性样品。其中阳性样品占比8.2%。

4.2 布鲁氏菌病调查结果

共计收集EDTA犬血液样品286份，275份符合实验要求，结果均为阴性。

4.3 钩端螺旋体病调查结果

共计收集EDTA犬血液样品286份，275份符合实验要求，结果共计检出阳性样品10份，占比3.6%。

5 结论

在2016年1月至12月期间，在朝阳区的四个街道的诊疗机构中采集的就诊动物样品的检测中，细菌类疾病犬布鲁氏菌病未检出，钩端螺旋体病检出率3.64%；寄生虫类疾病弓形体病检出率8.24%。

6 分析与讨论

6.1 布鲁氏菌病情况分析

我国人间布鲁氏菌病现状，自2007年至2015年感染人数年以来持续上升，发病区域以及感染人群都有了明显变化。多数观点认为有以下几点主要原因：（1）与社会环境有关；（2）与制度不健全有关；（3）群众自我防护意识淡漠；（4）旅游业对布病疫情波动的影响；（5）某些部门重视不够，配合不协调，布病防治队伍力量薄弱、业务素质不高。由于人的感染持续高位增长，导致动物饲养者对本病的关注度增加，宠物临床病例检测会随着人们意识水平的提高而加以重视。

6.2 钩端螺旋体病情况分析

钩端螺旋体病遍布世界各地，多种动物体内分离出来，热带和亚热带地区流行较严重。钩端螺旋体长期存在于患病动物的肾脏中，通过尿液间歇或者连续性的排出体外，污染水体和土壤，造成环境污染。本病可经皮肤黏膜，消化道以及胎盘垂直传播。20世纪50～60年代曾经在我国四川发生大流行，给广大人民造成严重损害。近年来河南，黑龙江报道发生人间感染钩端螺旋体的病例。钩端螺旋体病流行在6～10月，发病呈单峰状，与温度气候有极大的关系，同时与自然灾害相伴发生。2000年后，我国各地的发病率呈稳步的下降趋势[13]。北京地区属于温带季风气候，冬夏温差大，除夏季适于本病的传播，进入冬季不适合本病的传播。近年来，针对钩端螺旋体病的疫苗在动物临床上广泛使用，进一步有效的控制本病的传播。根据此次流行病学采样调查，宠物钩端螺旋体的携带比例3.6%。

分析原因：

首先，城市鼠患加快本病的扩散。钩端螺旋体的一个重要的储存宿主-老鼠，在北京这样的大城市分布广、数量的、繁殖快，与宠物的交集集中在城市草坪、绿化带、小区绿地等地，患病鼠尿液排放在草丛中，宠物通过皮肤黏膜、鼻黏膜等部位接触到，引起感染。

其次，宠物的生活环境和快速的交通状况有利于本病的传播。本次检测项目采样时间集中在北京冬季，本身不适于本病的传播，获得3.6%的携带动物比例，动物个体的南北方调运给本病的传播提供了有利条件。在今后的研究和流行病学调查方向将是以散发病例作为本病监测重点。

最后，患有本病的动物，临床表现差异较大，早期就诊时容易误诊，能够进行相应的血液检查，会有明显的白细胞变化，会指导动物医生使用抗生素治疗，一般的光谱抗生素对本病都有效。

6.3 弓形体病情况分析

首先，人间感染率持续上升，与宠物饲养的生活方式相关。弓形体病是由弓形体感染引起的人畜共患细胞内寄生虫病，本病呈世界性分布，人群普遍易感。根据九十年代对我国大连地区2016人的抗体检测重中，正常人群感染率为1.00%。根据我国2005年《全国人体重要寄生虫病现状调查报告》中，北京地区的弓形虫病感染率高于全国平均值，感染率高达9.615%[8]。同一时间深圳地区调查无偿献血人群680份血清标本总体感染率为7.21%，家庭妇女组IgG感染率高于其他组别，89名被调查者中有61人家中饲养猫与狗之类动物，接触动物可能是引起家庭妇女感染率增高的原因[8]。结合本次调查结果，犬类血液中携带比例高达8.2%，存在通过宠物传染人的风险。

其次，检测方法的改进，更客观的了解疫情。关于弓形体病的检测方法主要是血清学检测，通过测量IgG和Ig M抗体水平，来判断个体是处于感染急性期还是隐性感染期，对于动态的免疫抗体水平以及个体的免疫抑制、免疫缺陷等情况检测方法的偏差始终存在。本项目试验通过进行实时荧光PCR方法对弓形体的检测，能够对急性期或隐形感染的动物进行判定，还能够实现对免疫抑制和免疫缺陷的动物的检测，不受动物体自身免疫系统疾病的影响，更加客观的体现弓形体病在宠物犬的携带情况。

再次，为了深入了解本病，仍需扩大检测动物种类。猫和其他猫科动物是弓形体的终末宿主，它寄生在这些动物的小肠上皮细胞内，随形成的粪便排出体外，感染其他动物体。在此次项目中采样以犬的血液样品为主，所以，关于弓形体的检测仍然需要扩大采样范围，增加采样数量，才更客观有效。

最后，开展动物饲养者的有效教育。弓形体病有有效的治疗方法，但是治疗时间长，容易出现复发，同时患病动物没有强烈的临床症状，导致动物主人的不信任以及不配合，所以需要临床兽医进行更多的沟通和教育。

[1]侯加法，邓译峰.宠物犬猫常见人畜共患病[J].新兽医，2005，（7）：34-36.

[2]周艳彬，柳晓琳.布鲁氏菌病的流行、发病原因及防治进展[J].辽宁医学院学报，2010，31（1）：81-85.

王雅琴（1978-），女，兽医师，从事多年人畜共患病研究及实验室检测。

张海云（1964-），女，高级兽医师，从事多年人畜共患病研究。