双益方剂及其有效成分对胰岛素抵抗小鼠胰岛β细胞株胰岛素分泌、增殖、凋亡的影响

田春雨，马雷雷,喇孝瑾

(华北理工大学，河北唐山063210)

双益方剂及其有效成分对胰岛素抵抗小鼠胰岛β细胞株胰岛素分泌、增殖、凋亡的影响

田春雨，马雷雷,喇孝瑾

(华北理工大学，河北唐山063210)

目的观察双益方及其有效成分对胰岛素抵抗的小鼠胰岛β细胞株Min6胰岛素分泌水平和细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法培养Min6细胞并分为正常组、IR模型组、二甲双胍组、双益方组、双益方组方单味中药组(山茱萸、黄芪、黄连、葛根、桑白皮、佩兰)及双益方有效成分组(1-脱氧野尻霉素、小檗碱、黄芪甲苷、熊果酸、马钱苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素)。正常组加入无酚红培养液正常培养；其余各组加入葡萄糖和棕榈酸制作胰岛素抵抗的Min6细胞模型。二甲双胍组加入100 μg/L的二甲双胍。双益方组、山茱萸组、黄芪组、黄连组、葛根组、桑白皮组、佩兰组、葛根素组、1-脱氧野尻霉素组、小檗碱组、黄芪甲苷组、马钱苷组、熊果酸组、毛蕊异黄酮葡萄糖苷组分别加入50、100、200 μg/L的相应药物。各组于给药24 h后进行胰岛素分泌实验，检测胰岛素分泌水平。各组分别于给药24、48 h采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力。于给药24 h后采用双染法检测正常组、IR模型组、二甲双胍组、双益方组的凋亡细胞，计算细胞凋亡率；采用Western blotting法检测细胞中的ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白。结果IR模型组细胞高糖、低糖刺激下胰岛素分泌水平均低于正常组(P均<0.05)。二甲双胍组、黄芪组、葛根组、双益方组、黄芪甲苷组、山茱萸组、1-脱氧野尻霉素组、葛根素组、小檗碱组胰岛素分泌水平高于IR模型组(P均<0.05)。IR模型组细胞增殖能力低于正常组(P均<0.05)；二甲双胍组、双益方组、黄芪组、黄芪甲苷组、1-脱氧野尻霉素组、山茱萸组细胞增殖能力高于IR模型组(P均<0.05)。IR模型组细胞凋亡率高于正常组，双益方各组细胞凋亡率均低于IR模型组(P均<0.05)。IR模型组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量低于正常组(P均<0.05)；二甲双胍组及双益方组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量高于IR模型组(P均<0.05)。结论双益方及其黄芪、葛根、黄芪甲苷、山茱萸、1-脱氧野尻霉素、葛根素、小檗碱等成分可有效提高胰岛素抵抗的Min6细胞的胰岛素分泌水平，促进细胞增殖并抑制其凋亡，作用机制可能与ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白表达上调有关。

双益方；2型糖尿病；胰岛素抵抗；胰岛素分泌实验；细胞增殖；细胞凋亡；小鼠胰岛β细胞株

目前我国已成为世界上糖尿病患者人数最多的国家。研制安全有效、价格低廉的防治糖尿病的药物已成为研究热点和难点[1～4]。近年来中医药防治2型糖尿病取得了较大进展[5]。我们采用双益方治疗2型糖尿病取得了较好的调节糖代谢的效果。双益方组分为黄芪、葛根、山茱萸、桑白皮、黄连、佩兰，其有效成分可能包括1-脱氧野尻霉素、小檗碱、黄芪甲苷、熊果酸、马钱苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素[6～9]，但该复方具体的作用机制还不明确。为此，本实验建立了小鼠胰岛β细胞株Min6胰岛素抵抗(IR)模型，观察双益方及其有效成分对Min6细胞胰岛素分泌水平和细胞增殖、凋亡的影响，为双益方的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 Min6细胞购于上海复旦大学细胞库。DMEM培养基购于Gibco公司，胎牛血清购于GEMINI公司，双硫腙(DTZ)购于上海伊卡生物公司；CCK-8试剂购于DOJINDO公司，胰岛素分泌试剂盒购于Mercodia公司，Goat anti-rabbit、Anti-MEK1/2抗体、Anti-ERK1+ERK2 antibody购于ABCAM公司，Annexin V-FITC & PI细胞凋亡试剂盒购于Merckmillipore公司。M200PRO酶标仪(TECAN公司)，V3蛋白分析系统(Bio-Rad公司)。

1.2 细胞分组及IR模型制作 Min6细胞在含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、β-硫基乙醇的DMEM培养液中恒温培养。将Min6细胞以5×103/孔接种于96孔板，继续培养24 h。将细胞分为正常组、IR模型组、二甲双胍组、双益方组、双益方组方单味中药组(山茱萸、黄芪、黄连、葛根、桑白皮、佩兰)及双益方有效成分组(1-脱氧野尻霉素、小檗碱、黄芪甲苷、熊果酸、马钱苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素)。正常组加入无酚红培养液100 μL正常培养；其余各组加入21 mmol/L的葡萄糖、0.37 mmol/L的棕榈酸100 μL制作IR的Min6细胞模型(细胞增殖能力、胰岛素分泌能力显著降低为成模标准)[10～12]。

1.3 各组给药方法 二甲双胍组给予100 μg/L的二甲双胍。双益方组分别给予50、100、200 μg/L的双益方。山茱萸组、黄芪组、黄连组、葛根组、桑白皮组、佩兰组、葛根素组、1-脱氧野尻霉素组、小檗碱组、黄芪甲苷组、马钱苷组、熊果酸组、毛蕊异黄酮葡萄糖苷组分别给予50、100、200 μg/L的相应药物。

1.4 胰岛素分泌情况观察 采用胰岛素分泌实验。各组于给药24 h后以低糖(2.8 mmol/L)作用2 h，抽取细胞上清液，检测胰岛素分泌情况；抽取上清液后的各孔细胞再给予高糖(16.7 mmol/L)作用2 h，收集细胞上清液，检测胰岛素分泌情况。

1.5 细胞增殖能力检测 各组分别于给药24、48 h时每孔加入10 μL的细胞增殖能力检测试液，按试剂盒说明书进行操作。以OD值代表细胞的增殖能力[13，14]。

1.6 凋亡细胞检测 于给药24 h后采用双染法检测正常组、IR模型组、二甲双胍组、双益方组的凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.7 细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白检测 于给药24 h后采用Western blotting法检测正常组、IR模型组、二甲双胍组、双益方组细胞中的ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白。蛋白相对表达量用灰度值表示[15,16]。

2 结果

2.1 各组细胞胰岛素分泌水平比较 IR模型组细胞高糖、低糖刺激下胰岛素分泌水平均低于正常组(P均<0.05)。二甲双胍组、黄芪组、葛根组、双益方组、黄芪甲苷组、山茱萸组、1-脱氧野尻霉素组、葛根素组、小檗碱组胰岛素分泌水平高于IR模型组(P均<0.05)。详见表1。

2.2 各组细胞增殖能力比较 IR模型组细胞增殖能力低于正常组(P均<0.05)；二甲双胍组、双益方组、黄芪组、黄芪甲苷组、1-脱氧野尻霉素组、山茱萸组细胞增殖能力高于IR模型组，且随着药物作用浓度升高，细胞增殖能力增强(P均<0.05)。详见表1。

2.3 细胞凋亡情况比较 正常组、IR模型组、二甲双胍组、双益方50 μg/L组、双益方100 μg/L组、双益方200 μg/L组细胞凋亡率分别为30.10%、42.60%、28.10%、32.35%、26.30%、14.45%，IR模型组细胞凋亡率高于正常组，双益方50 μg/L组、双益方100 μg/L组、双益方200 μg/L组细胞凋亡率低于IR模型组(P均<0.05)。

2.4 各组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达比较 IR模型组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量低于正常组(P均<0.05)；二甲双胍组及双益方组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量高于IR模型组(P均<0.05)。详见表2。

3 讨论

胰岛β细胞功能失调和细胞凋亡是导致胰岛素分泌减少的主要原因，也在2型糖尿病IR发生过程中发挥重要作用。对胰岛β细胞进行保护、改善胰岛素分泌水平是2型糖尿病治疗的关键。Min6细胞在高糖浓度作用时胰岛素分泌量明显增加，常作为研究药物对胰岛功能影响的经典细胞。本实验采用Min6细胞制作IR模型，观察双益方、组方中药及其有效成分对Min6细胞胰岛素分泌、细胞增殖和凋亡的影响，分析复方的有效成分及作用机制。

表1 各组细胞胰岛素分泌水平及OD值比较

注：与正常组相比，*P<0.05；与IR模型组相比，#P<0.05；与二甲双胍组相比，※P<0.05。

表2 各组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白 相对表达量比较

注：与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

高糖导致β细胞分泌胰岛素功能障碍和胰岛β细胞数量减少。高糖刺激能够导致胰岛素分泌负荷增大，分泌能力下降，低糖条件下胰岛素分泌能力会升高。本研究胰岛素分泌实验结果显示，IR模型组细胞高糖、低糖刺激下胰岛素分泌水平均低于正常组；二甲双胍组、黄芪组、葛根组、双益方组、黄芪甲苷组、山茱萸组、1-脱氧野尻霉素组、葛根素组、小檗碱组胰岛素分泌水平高于IR模型组。上述结果提示二甲双胍、双益方、小檗碱、山茱萸、葛根、黄芪甲苷、黄芪、1-脱氧野尻霉素、葛根素可在一定程度上促进高糖刺激及低糖刺激条件下的胰岛素分泌，以双益方、黄芪、黄芪甲苷、1-脱氧野尻霉素促进胰岛素分泌的效果较好。本研究结果还显示，IR模型组细胞增殖能力低于正常组，细胞凋亡率高于正常组；二甲双胍组、双益方组、黄芪组、黄芪甲苷组、1-脱氧野尻霉素组、山茱萸组细胞增殖能力高于IR模型组，双益方各组细胞凋亡率低于IR模型组。上述结果证实了胰岛β细胞凋亡与IR的发生有关，而双益方可能通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡干预IR的进展。

丝裂原活化蛋白激酶的信号转导通路在胰岛β细胞增殖等过程中可发挥重要作用。Ras-Raf-MEK-ERK通路为经典的丝裂原活化蛋白激酶的信号转导通路。我们观察了各组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达变化，发现IR模型组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量低于正常组，二甲双胍组及双益方组细胞中MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量高于IR模型组，提示双益方抑制Min6细胞凋亡可能是通过调节Ras-Raf-MEK-ERK通路功能实现的。

结合上述研究结果，我们认为，双益方及其黄芪、葛根、黄芪甲苷、山茱萸、1-脱氧野尻霉素、葛根素、小檗碱等成分可有效提高IR Min6细胞的胰岛素分泌水平，促进Min6细胞增殖并抑制其凋亡，作用机制可能与ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白表达上调有关。双益方调节胰岛素分泌是其组方中药及有效成分共同作用的结果。

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EffectsofShuangyidecoctionanditsactiveingredientsoninsulinsecretionproliferationandapoptosisofIRmousepancreaticβcellstrain

TIANChunyu,MALeilei,LAXiaojin

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063210,China)

ObjectiveTo observe the effects of Shuangyi decoction (SY) and its effective ingredients on the insulin secretion, cell proliferation, and apoptosis of islet β cells Min 6 in insulin resistant (IR) mice, and to analyze the action mechanism.MethodsWe cultured Min6 cells and then divided them into the normal group, IR model group, metformin group, SY group, single herb of SY group [Cornus officinalis (Shanzhuyu), Astragalus membranaceus (Huangqi), Coptis chinensis (Huanglian), Puerarin (Gegen), Cortex mori radicis (Sangbaipi), and Eupatorium (Peilan)], and SY effective ingredient group (1-deoxynojirimycin, berberine, astragaloside, ursolic acid, loganin, calycosin glucoside, and puerarin). The normal group was cultured with phenol red free medium; the other groups were added with glucose and palmitic acid in order to make the Min6 cell IR models. Metformin group was added with 100 g/L metformin. SY group, Shanzhuyu group, Huangqi group, Huanglian group, Gegen group, Sangbaipi group, Peilan group, 1-deoxynojirimycin, berberine, astragaloside, ursolic acid, loganin, calycosin glucoside, puerarin groups were added with 50, 100, and 200 g/L the corresponding drugs. Insulin secretion test was performed at 24 h after administration, and the level of insulin secretion was detected. The proliferation ability of cells at 24 h and 48 h after administration was detected by CCK-8 kit. Apoptotic cells were detected at 24 h after administration by double staining in the normal group, IR model group, metformin group, and SY group; the apoptotic rate was also calculated; the protein exoression of ERK1/2, p-ERK1/2, MEK1/2 was detected by Western blotting.ResultsUnder the condition of high glucose and low sugar, the insulin secretion of the IR model group was lower than that of normal group (P<0.05). The insulin secretion levels of the metformin group, Huangqi group and Gegen group, SY group, astragaloside group, Shanzhuyu group, 1-deoxynojirimycin group, puerarin group, and berberine group were higher than that of the IR model group (allP<0.05). The cell proliferation ability of IR model group was lower than that of the normal group (P<0.05); the cell proliferation abilities of the metformin group, SY group, Huangqi group, astragaloside group, 1- deoxynojirimycin group, and Shanzhuyu group were higher than that of IR model group (P<0.05). The apoptosis rate of the IR model group was higher than that of the normal group, and the apoptosis rate of the SY group was lower than that of the IR model group (P<0.05). The expression levels of MEK1/2, ERK1/2, and p-ERK1/2 proteins were lower in the IR model group than in the normal group (P<0.05); the expression levels of MEK1/2, ERK1/2, and p-ERK1/2 proteins were higher in the metformin group and SY group than in the IR model group (allP<0.05).ConclusionsSY, and its effective ingredients Huangqi, Gegen, astragaloside, Shanzhuyu,1-deoxynojirimycin, puerarin, and berberine can effectively improve the IR Min6 cell insulin secretion, promote Min6 cell proliferation and inhibit the apoptosis by up-regulating the expression of ERK1/2, p-ERK1/2 and MEK 1/2 protein.

Shuangyi decoction; type 2 diabetes mellitus; insulin resistance; insulin secretion test; cell proliferation; apoptosis; mouse pancreatic β cell strain

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.006

R587.1

A

1002-266X(2017)39-0023-04

河北省自然科学基金资助项目(H2015209025)；河北省高等学校科学技术研究项目(QN2015119)。

田春雨(1981-)，男，博士，副教授，主要研究方向为糖尿病的中药防治。E-mail： tcy4479@sina.com

2017-06-20)