弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中Bcl-6基因异常情况及其临床意义

于海，张云香，王慧，张娜

(1潍坊医学院,山东潍坊 261053；2潍坊市人民医院)

弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中Bcl-6基因异常情况及其临床意义

于海1，张云香2，王慧2，张娜2

(1潍坊医学院,山东潍坊 261053；2潍坊市人民医院)

目的观察弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中Bcl-6基因异常情况，并分析其与临床病理特征的关系。方法DLBCL患者42例，采用Bcl-6双色断裂点分离探针荧光原位杂交技术检测Bcl-6基因，采用免疫组织化学方法检测Bcl-6蛋白表达，采用χ2检验分析Bcl-6基因异常与DLBCL临床病理特征的关系。结果42例DLBCL患者中发生Bcl-6基因易位6例，发生Bcl-6基因扩增3例，Bcl-6蛋白表达阳性19例。Bcl-6基因易位患者Bcl-6蛋白表达阳性率较无易位者高(P=0.014)；Bcl-6基因是否易位患者DLBCL分型、性别、年龄比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。Bcl-6基因是否扩增患者Bcl-6蛋白表达、DLBCL分型、性别、年龄比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论DLBCL中Bcl-6基因存在易位和扩增两种情况，并且Bcl-6基因易位与患者Bcl-6蛋白表达有密切的联系。

弥漫性大B细胞淋巴瘤；Bcl-6；基因异常；临床指标

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一种高度异质性的淋巴系统恶性肿瘤，是最常见的侵袭性淋巴瘤。在欧美国家，DLBCL占非霍奇金淋巴瘤的30%左右，而在我国，其发病率高达40%。既往大量证据证实，不同类型的淋巴瘤在基因学、病理形态以及治疗反应性等方面均存在明显差异，尤其是基因异常改变对指导疗效和评估预后具有十分重要的临床意义。因此，深入研究各种类型的分子遗传学特征，进一步了解其具体的发病机制并为精准医疗提供理论依据已成为当前研究的热点。Bcl-6是一种具有下调基因转录而抑制细胞凋亡功能的原癌基因。生理情况下，Bcl-6只表达于生发中心。当发生DLBCL后，Bcl-6因发生断裂重排或扩增，异常表达的Bcl-6可以通过抑制PRDM1和p53等的表达从而促进DLBCL的发生和发展[1]。故存在Bcl-6基因异常的患者预后不佳。最近，在2016版世界卫生组织(WHO)淋巴肿瘤修订分类中，将伴MYC和Bcl-2和(或)Bcl-6重排的该部分患者分类为高侵袭性B细胞淋巴瘤[2]。可见，进一步明确Bcl-6基因在DLBCL中的异常改变对指导临床具有重要意义。本研究观察了DLBCL中Bcl-6基因异常情况，并分析其与临床病理特征的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集潍坊市人民医院病理科2015年1月～2016年10月病理首次诊断为DLBCL的患者42例。其中男26例、女16例，年龄43～80(58.91±12.31)岁。分型参照2008年WHO关于造血与淋巴组织肿瘤分类标准[3]，其中GBC型16例、n-GCB型26例。纳入标准：全部病例诊断均符合《2008年WHO淋巴瘤诊断标准》；全部研究对象均未接受化疗或放疗；年龄≥18岁，资料完整。排除坏死性淋巴结炎、传染性单核细胞增多症、转移性肿瘤和髓外白血病等疾病。标本部位：浅表淋巴结27例，皮下软组织6例，胃肠道6例，肠系膜、脾各1例，扁桃体1例。标本均经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，制作成简易组织芯片蜡块。

1.2 Bcl-6基因检测 采用荧光原位杂交技术(FISH)。3 μm石蜡切片常规处理后，使用Bcl-6双色断裂点分离探针(北京金菩嘉，中国)检测Bcl-6基因，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。在荧光显微镜(Olympus BX51，日本)下观察，应用FISH图像分析软件进行图像采集、分析和保存。正常Bcl-6基因表现为2个红色和绿色荧光融合的黄色信号；Bcl-6基因易位显示为1个红色、1个绿色、1个黄色信号；Bcl-6基因扩增显示为≥3个黄色信号。将20例反应性增生的淋巴结标本按上述方法进行FISH实验，每份样本分析200个细胞，计算出异常信号的细胞数，百分比平均数及标准差，阳性阈值=平均值+3倍标准差。本研究将Bcl-6基因易位阳性阈值定义为11%，即分析100个肿瘤细胞中出现11个及11个以上阳性细胞即判断为Bcl-6基因易位。Bcl-6基因扩增阳性阈值定义为12%，即分析100个间期细胞中出现12个及12个以上细胞显示≥3个黄色信号判断为Bcl-6基因扩增。

1.3 Bcl-6蛋白表达检测 采用免疫组织化学法。石蜡切片常规脱蜡后，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法检测观察组组织中Bcl-6蛋白表达水平(兔抗人单克隆抗体，1∶100，北京中杉金桥，中国)。DAB显色后，苏木素复染。PBS缓冲液替代一抗作为空白对照。染色步骤严格按照说明书进行。结果判定：蛋白阳性呈棕褐色、棕黄色或浅黄色表达，主要位于细胞核。根据既往蛋白免疫组化判读标准[4]，以肿瘤组织中阳性细胞百分率计数。同时，按照Hans等[5]分类标准，最终将Bcl-6蛋白>30%定义为阳性表达。所有评判均由两名高年资病理医师完成。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。各因素组间差异比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL患者Bcl-6基因异常情况 42例DLBCL患者中发生Bcl-6基因易位6例，发生Bcl-6基因扩增3例，无Bcl-6基因扩增重排，Bcl-6基因异常率为21.43%。

2.2 DLBCL患者Bcl-6蛋白表达情况 42例DLBCL患者中Bcl-6蛋白表达阳性19例。

2.3 Bcl-6基因易位与DLBCL临床病理特征的关系 见表1。

表1 Bcl-6基因易位与DLBCL临床病理特征的关系(例)

2.4 Bcl-6基因扩增与DLBCL临床病理特征的关系 见表2。

表2 Bcl-6基因扩增与DLBCL临床病理特征的关系(例)

3 讨论

既往大量证据表明，DLBCL患者无论在临床表现、病理形态、治疗反应性及预后，还是肿瘤细胞的表型及基因遗传学均表现出高度异质性[6]。近年来随着分子遗传学领域研究的不断发展，人们发现基因异常在DLBCL发生发展、指导治疗方案和评估预后起着重要的作用。其中，Bcl-6基因异常是调控DLBCL发生发展的关键基因之一。研究显示，Bcl-6基因不仅在调控B细胞生发中心的形成中起重要作用[7]，而且可以通过调节B细胞的活化、分化、细胞周期和凋亡作用影响DLBCL[8]。Bcl-6基因生物学活动是一个复杂的多信号传导的级联反应,作用机制仍不十分清楚。目前有证据表明，Bcl-6基因的突变和染色体异位是发生肿瘤的基础，也是Bcl-6基因异常最主要的两种方式。当Bcl-6基因发生易位或扩增后，其蛋白表达失去有效的调节，异常表达的Bcl-6可以直接调节肿瘤细胞的分化、增殖和凋亡而直接促进肿瘤生长[9]。此外，Bcl-6基因亦能通过调节其他基因的表达而调节肿瘤生长，如STAT和Blimp-1等[10]。这也提示，相关基因异常可能是引起DLBCL不同治疗反应性和预后差异的重要原因。因此，研究相关基因的具体作用机制对指导临床治疗和评估预后具有至关重要的意义。

既往大量证据表明，MYC基因异常可作为Burkitt淋巴瘤的遗传学特征之一。但对于DLBCL，则缺乏特异性的分子遗传学标志物。国内外研究发现，DLBCL患者中存在较常见的Bcl-6基因异常。国外研究报道，Bcl-6基因易位在DLBCL中检出率为23.1%[11]；而我国研究显示，Bcl-6基因易位检出率高达57.5%[12]。这提示，地区差异可能是发生Bcl-6基因异常差异的重要原因。本研究DLBCL患者Bcl-6基因异常检出率仅为21.43%，与国内其他学者报道不同，原因可能与纳入的研究对象有关。

本研究结果显示，42例DLBCL患者中发生Bcl-6基因易位者6例，且6例患者全部表达为Bcl-6蛋白。而Bcl-6蛋白阴性患者中，无基因易位者。这提示，Bcl-6基因易位与蛋白表达之间有密切的相关性。按照Hans分型标准，将全部研究对象分为GCB型和non-GCB型后，进一步分析结果显示，Bcl-6基因易位与Hans分型无相关性，这提示，在临床上不能通过Hans分型来评估患者的Bcl-6基因易位情况。同时，本研究亦显示，Bcl-6基因易位与患者性别和年龄无相关性。

此外，本研究结果显示，有3例患者发生Bcl-6基因扩增(7.14%)，这与韩永胜等[13]报道的Bcl-6基因扩增检出率为17.2%差异较大，原因可能有多种。3例发生Bcl-6基因扩增患者中蛋白表达阴性2例、阳性1例。进一步分析显示，Bcl-6基因扩增病例与无扩增病例中的Bcl-6蛋白表达、性别及年龄均无统计学差异。

综上所述，DLBCL中Bcl-6基因存在易位和扩增两种情况，并且Bcl-6基因易位与患者Bcl-6蛋白表达有密切的联系。因此，对于Bcl-6蛋白表达阳性的患者，发生Bcl-6基因易位的可能性大，建议行FISH检测,从而指导其临床治疗。Bcl-6基因扩增也是DLBCL中基因异常的重要方式，目前国内外研究较少，对其作用机制尚缺乏了解，值得进行深入研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.024

R733.4

B

1002-266X(2017)38-0076-03

山东省潍坊市科学技术发展计划项目(20100220)。

张云香(E-mail： zhangbing199592@163.com)

2017-07-10)