TGF-β1、Slug及E-cadherin 在胆管癌组织中的表达及意义

王文斌，乔子洋，刘 兵，王天阳，张文明，吕海涛*

(1.河北医科大学第二医院肝胆外科，河北 石家庄 050000；2.河北医科大学第三医院肿瘤科，河北 石家庄 050051)

·论著·

TGF-β1、Slug及E-cadherin 在胆管癌组织中的表达及意义

王文斌1，乔子洋1，刘 兵2，王天阳1，张文明1，吕海涛1*

(1.河北医科大学第二医院肝胆外科，河北 石家庄 050000；2.河北医科大学第三医院肿瘤科，河北 石家庄 050051)

目的探讨TGF-β1、Slug和E-cadherin在胆管癌组织中的表达并分析其临床意义。方法采用免疫组织化学SP法检测TGF-β1、slug和E-cadherin在70例胆管癌组织和20例癌旁组织中的表达情况，分析其临床意义。结果70例胆管癌、20例胆管癌癌旁组织中TGF-β1、Slug和E-cadherin阳性表达率差异均有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1和Slug阳性表达率在淋巴结转移者高于无淋巴结转移者(P<0.05)，在肝动脉或门静脉受侵者高于无受侵者(P<0.05)。E-cadherin阳性表达率在淋巴结转移者低于无淋巴结转移者(P<0.05)，在肝动脉或门静脉受侵者低于无受侵者(P<0.05)。胆管癌组织中，TGF-β1与Slug表达呈正相关(rs=0.658,P=0.000)；TGF-β1与E-cadherin表达呈负相关(rs=-0.527,P=0.000)；Slug与E-cadherin表达呈负相关(rs=-0.526,P=0.000)。结论TGF-β1、Slug及E-cadherin表达对胆管癌的发生发展可能发挥重要的作用。

胆管肿瘤;转化生长因子β1；桥粒钙黏蛋白质类

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.11.007

胆管癌分为肝内胆管癌和肝外胆管癌，肝外胆管癌又分为肝门胆管癌和远端胆管癌，预后差，中位生存期只有24个月[1]。由于手术技术以及手术器械的进步，手术切除率逐年提高，但是仍有许多患者由于门静脉或肝动脉受侵、受累肝叶硬化萎缩、肝功能受损等原因无法得到有效治疗，急需寻找新的治疗思路提高疗效[2]。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)是细胞恶性转化的重要基础[3]。发生EMT的肿瘤细胞表现为锌指转录抑制因子Slug表达增强，上皮细胞标志物E-cadherin表达降低，肿瘤细胞侵袭转移能力增强。转化生长因子(transforming growth factor，TGF-β1)具有诱导肿瘤细胞发生EMT的作用[4]。三者在胆管癌中共同表达的研究未见报道。本研究采用免疫组织化学技术检测并观察TGF-β1、Slug和E-cadherin在胆管癌中的表达并探讨其临床意义。

1 资 料 与 方 法

1.1 标本收集 收集2010年9月—2016年7月河北医科大学第三医院手术切除经病理证实的胆管癌标本70例，男性27例，女性43例，年龄35～75岁，平均(60.0±8.5)岁；肿瘤直径≥2 cm的57例，<2 cm的13例；淋巴结转移43例，无淋巴结转移27例；组织学分级低分化20例，中分化18例，高分化32例；门静脉或肝动脉受侵21例。所有患者术前未经放、化疗。20例癌旁组织作为对照组。

1.2 试剂 兔抗人TGF-β1多克隆抗体为美国Genetex公司产品，兔抗人Slug、E-cadherin多克隆抗体为英国Abcam公司产品，免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 检测方法 采用免疫组织化学链霉亲和素-过氧化物酶(streptavidin perosidase,SP)法检测标本中TGF-β1、Slug和 E-cadherin蛋白的表达。组织蜡块连续切片，厚度44 μm，65 ℃烘烤 24 h 备用。常规脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min。无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min。放入95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各3 min，80%乙醇3 min。磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗10 min。3%双氧水封闭，避光置于摇床20 min。蒸馏水洗5 min。 PBS冲洗5 min×3次。切片在枸橼酸钠溶液高压锅内中火加热，计时5 min。自然冷却40～50 min。PBS 冲洗5 min×3次。滴加SP试剂盒A试剂，试剂滴加完成后37 ℃恒温箱孵育20 min。去除A液，滴加一抗(TGF-β1 1∶200，Slug1∶200，E-cadherin 1∶200，均由PBS稀释)，4 ℃冰箱过夜。放置30 min至室温，PBS 冲洗5 min×3次。滴加SP试剂盒B试剂，37℃恒温箱孵育20 min。PBS冲洗5 min×3次，滴加SP试剂盒C试剂，37℃恒温箱20 min孵育。PBS冲洗5 min×3次。3,3′-二氨基联苯胺盐酸盐显色液显色，显色时间为TGF-β1 60 s、Slug 30 s、E-cadherin 30 s。苏木精复染30 s。盐酸酒精分化1 s。梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。以结肠癌组织切片作为阳性对照，阴性对照以PBS替代一抗。

1.4 结果判定 TGF-β1表达主要定位于细胞浆，呈棕黄色或棕褐色颗粒；Slug表达以胞核伴或不伴胞浆出现棕黄色染色颗粒；E-cadherin的表达主要定位于细胞膜，呈棕黄色颗粒。以阳性细胞百分数和染色深浅两方面综合评分。按阳性区域染色强度评分：阴性为0分，浅染色为1分，中等染色为2分，强染色为3分，极强染色记为4分。光镜下计数300个细胞，并计算阳性细胞百分比。阳性细胞百分比为：≤10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。最终染色评分为两项积分相加：7～8分为强阳性(+++)，4～6分为阳性(++)，2～3分为弱阳性(+)，0～1分为阴性(-)。

1.5 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验；相关性采用Spearman等级相关分析；生存率分析采用Kaplan-Meier法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TGF-β1、Slug及E-cadherin在胆管癌组织中的表达 TGF-β1表达主要定位于细胞浆，呈棕黄色，在胆管癌组阳性表达47例(67.1%)，在癌旁组织阳性表达率为5例(25.0%)，差异有统计学意义(χ2=11.325，P=0.001)(图1)。Slug以胞核伴或不伴胞浆出现棕黄色染色即判定为阳性，Slug在胆管癌组阳性表达率为44例(62.9%)，在癌旁组织表达阳性率为6例(30.0%)，差异有统计学意义(χ2=6.801，P=0.009)(图2)。E-cadherin表达主要定位于细胞膜，呈棕黄色颗粒，在胆管癌组阳性表达率为29例(41.4%)，在癌旁组织阳性表达率为16例(80.0%)，差异有统计学意义(χ2=9.257，P=0.002)(图3)。

图1胆管癌组织中TGF-β1蛋白的表达(免疫组织化学染色×200)
Figure1ExpressionofTGF-β1incholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×200)

图2胆管癌组织中Slug蛋白的表达(免疫组织化学染色×200)
Figure2ExpressionofSlugincholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×200)

图3胆管癌组织中E-cadherin蛋白的表达(免疫组织化学染色×200)
Figure3ExpressionofE-cadherinincholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×200)

2.2 不同临床病理参数TGF-β1、Slug及E-cadherin蛋白的表达 不同年龄、不同肿瘤大小和肿瘤不同分化程度之间差异无统计学意义(P>0.05)。有肝动脉或门静脉受侵者TGF-β1阳性表达率、Slug阳性表达率高于无肝动脉或门静脉受侵者(P<0.05)；有肝动脉或门静脉受侵者E-cadherin阳性表达率低于无肝动脉或门静脉受侵者(P<0.05)。 有淋巴结转移者TGF-β1和Slug阳性表达率高于无淋巴结转移者(P<0.05)；E-cadherin阳性表达率低于无淋巴结转移者(P<0.05)。见表1。

表1 TGF-β1、Slug及E-cadherin表达与胆管癌临床病理特征的关系Table 1 Relationship between expression of TGF-β1，Slug and E-cadherin in cholangiocarcinoma and clinicalpathlogical factors

2.3 TGF-β1、Slug及E-cadherin表达相关性分析 70例胆管癌组织标本中，TGF-β1与Slug共同阳性表达40例，共同阴性表达19例，二者在胆管癌组织标本中表达呈正相关(rs=0.658,P=0.000)；70例胆管癌组织标本中，TGF-β1与E-cadherin共同阳性表达28例，共同阴性表达22例，二者在胆管癌组织标本中表达呈负相关(rs=-0.527,P=0.000)；70例胆管癌组织标本中，Slug与E-cadherin共同阳性表达27例，共同阴性表达24例，二者在胆管癌组织标本中表达呈负相关(rs=-0.526,P=0.000)。 见表2。

表2 TGF-β1、Slug及E-cadherin表达的相关性分析Table 2 Correlation analysis of E-cadherin，TGF-β1 and Slug expression (例数)

3 讨 论

胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤。典型的上皮细胞为高度有序的单层细胞，形态均一，细胞间有规律地紧密黏附在一起。间质细胞形态各异，缺乏规律，细胞间黏附力小，有很强的迁移侵袭能力。近年大量研究表明EMT在肿瘤侵袭转移过程中起重要作用[5]。EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的病理生理过程，表现为上皮细胞极性丧失及获得间质细胞转移能力，EMT最基本的条件是细胞形态、黏附力及迁移力的改变。以EMT发生的生物学环境分为3型，其中Ⅲ型指上皮源性肿瘤相关的表型转化，具有5条调控通路，代表性分子改变主要包括：调控转录因子表达上调如Twist、Snail、Slug、NF-kB等，vimentin表达上调，E-cadherin表达下调。研究发现EMT在胆管癌的发生机制中发挥重要的作用，有可能成为新的治疗靶点[6]。EMT的发生机制非常复杂，涉及众多的生长因子、转录调节因子和细胞通路。胆管癌的发生与原发性硬化性胆管炎、胆管结石、胆汁淤积等胆管慢性炎症刺激有关，属于炎症性肿瘤范畴，其中TGF-β1升高非常明显。

人类TGF-β1基因定位于染色体19q3，含有7个外显子，其5′端序列含有5个调控区：1个类增强子活性区，2个负调控区和2个启动子区，对细胞分化和免疫功能等方面发挥重要作用。近年来发现，TGF-β1还具有促进肿瘤血管形成、侵袭转移和免疫抑制的作用，与肿瘤发生发展关系密切。TGF-β1在肿瘤发生发展中发挥双重作用，肿瘤的起始阶段，抑制细胞的增殖，诱导细胞凋亡，而在肿瘤进展期，通过多种信号通路诱导调控EMT，促进新生血管形成，肿瘤细胞侵袭和转移。目前，TGF-β1被认为是诱导EMT最重要的生长因子。研究表明TGF-β1异常表达可影响肝内胆管癌的恶性生物学行为，是判断预后的重要指标[7]；同时还可以促进EMT的发生，影响胆管癌的发生发展[8]。

Snail超家族编码锌指转录抑制因子，一般由1个含有4～6个锌指的高度保守的羟基和1个氨基末端组成，锌指是C2H2型。Snail家族分为Snail和Slug亚家族。Slug位于染色体8q11.21，cDNA全长2.4 kb，含有3个外显子，2个内含子，是EMT过程的重要调控因子，其以锌指与E-cadherin启动子上的E-box结合后，作为转录抑制蛋白，特异抑制黏附连接成分，减少细胞间黏附，促使肿瘤细胞脱离原发灶发生侵袭转移。国内学者应用小干扰RNA技术，靶向沉默胰腺癌细胞MIAPaca-2中Slug的表达，导致E-cadherin表达明显上调，显著抑制胰腺癌细胞的侵袭转移能力。而转染DNAJC6的肝癌细胞HepG2 Slug基因表达明显升高，E-cadherin和ZO-1基因表达显著下降，诱导了EMT的发生[9]。

E-cadherin是一种钙依赖细胞间黏附分子，也称为Uvomorulin、L-CAM或Cell-CAM120/80，基因定位于人类16号染色体的长臂上(16 q22,1)，长度为100 kb，含有16个外显子和15个内含子。E-cadherin蛋白包括3个区域：N端细胞外区、跨膜区和C端细胞质区。人体的各种上皮细胞的细胞质和细胞膜上均存在着E-cadherin蛋白，在保持细胞的极性和完整性等方面发挥重要作用。E-cadherin在各种上皮性肿瘤中表达下调或消失[10]，并且与肿瘤的浸润转移和预后密切相关，被认为是一种肿瘤转移抑制因子。国内学者采用小干扰RNA沉默胃癌细胞S100A2和E-cadherin基因后，细胞生长速度和细胞侵袭力均明显增加，S100A2和E-cadherin蛋白证实具有抑制细胞增殖和侵袭的能力[11]。

目前，TGF-β1、Slug及E-cadherin在胆管癌中的共表达情况以及相关性研究未见报道。本研究结果显示，TGF-β1与Slug在胆管癌组织中的表达率较癌旁组织中的表达明显升高[67.1%(47/70)vs25.0%(5/20)；62.9%(44/70)vs30.0%(6/20)]，而E-cadherin在胆管癌组织中的表达率较癌旁组织中的表达明显降低[41.4%(29/70)vs80.0%(20/16)]。说明TGF-β1、Slug及E-cadherin的异常表达可能促进了胆管癌的发生。进一步研究发现，TGF-β1和Slug表达随着胆管癌组织淋巴结转移、肝动脉或门静脉受侵的发生而增强，E-cadherin表达随着胆管癌组织淋巴结转移、肝动脉或门静脉受侵的发生而降低，组间差异均有统计学意义，相关性分析表明TGF-β1与Slug存在明显的正相关关系，而TGF-β1、Slug与E-cadherin存在明显的负相关关系。说明TGF-β1可能促进了胆管癌EMT的发生，并通过促进Slug的表达抑制了E-cadherin的表达，导致胆管癌细胞间黏附能力下降，癌细胞脱离原发灶而黏附种植于远处器官，促进了肿瘤的淋巴转移和血管侵犯。因此，TGF-β1、Slug及E-cadherin可作为判断胆管癌生物学行为的重要指标，并且可能影响患者的预后。

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TheexpressionandclinicalsignificanceofTGF-β1、SlugandE-cadherinincholangiocarcinoma

WANG Wen-bin1, QIAO Zi-yang1, LIU Bing2, WANG Tian-yang1, ZHANG Wen-ming1, LV Hai-tao1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China; 2.DepartmentofOncology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveTo investigate the expression of TGF-β1, Slug and E-cadherin in cholangiocarcinoma tissues and their clinical significance.MethodsImmunohistochemical SP method was used to detect the expression of TGF-β1, Slug and E-cadherin in 70 cases of cholangiocarcinoma and 20 cases of para-tumor tissue. The clinical significance were analyzed. The correlation between expression of TGF-β1, Slug and E-cadherin was analyzed by Spearman analysis method.ResultsThe positive expression rates of TGF-β1, Slug and E-cadherin in cholangiocarcinoma tissue were significantly different from those in para-tumor tissue(P<0.05). The positive expression rates of TGF-β1 and Slug were significantly higher in lymph node metastasis and hepatic artery or portal vein invasion patients than those in no lymph node metastasis(P<0.05)and hepatic artery or portal vein invasion patients(P<0.05). The positive expression rates of E-cadherin were significantly lower in lymph node metastasis and hepatic artery or portal vein invasion patients than those in no lymph node metastasis(P<0.05)and hepatic artery or portal vein invasion patients(P<0.05). There was a positive correlation between TGF-β1 and Slug expression in cholangiocarcinoma(rs=0.658,P=0.000). There were negative correlations between TGF-β1 and E-cadherin(rs=-0.527,P=0.000). The expression of Slug was negatively correlated with the expression of E-cadherin(rs=-0.526,P=0.000).ConclusionThe abnormal expressions of TGF-β1, Slug and E-cadherin may play an important role in carcinogenesis and progression of cholangiocarcinoma.

bile duct neoplasms； transforming growth factor beta 1; desmosomal cadherins

2017-07-10；

2017-09-27

王文斌(1973-)，男，河北保定人，河北医科大学第二医院副主任医师，医学博士，从事肝胆胰脾疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail:wwb2981@163.com

R735.8

A

1007-3205(2017)11-1271-05

(本文编辑：许卓文)