悬浮芯片HPA基因分型方法的建立及评价研究*

安群星，党 璇，胡兴斌，易 静，尹 文

第四军医大学第一附属医院输血科(西安 710032)

悬浮芯片HPA基因分型方法的建立及评价研究*

安群星，党 璇，胡兴斌，易 静，尹 文△

第四军医大学第一附属医院输血科(西安 710032)

目的：建立一种准确、高通量的人类血小板抗原(HPA)基因分型方法。方法：采用多重PCR及连接酶技术扩增22种HPA基因，将扩增产物与包被在微球上的特异性探针杂交，通过Bio-Plex悬浮芯片阅读仪判定HPA基因型，将检测结果与聚合酶链反应-测序分型(PCR-SBT)结果比较。结果：成功建立了悬浮芯片HPA基因分型方法并对西安市汉族献血者血液样品进行基因分型，检测结果与PCR-SBT分型结果完全一致。结论：真正建立了一种准确、高通量的HPA分型方法，对临床血小板HPA分型输注以及建立已知HPA供者库具有重要意义。

人类血小板抗原(Human platelet antigen,HPA)是血小板糖蛋白携带的一类特异性抗原，目前发现有24种，其中22种HPA的基因结构已完全清楚。全面、准确地鉴定HPA型别，对于开展血小板HPA同型输注，减低同种免疫反应的发生，以及建立已知HPA型别血小板供者库等均具有重要意义。我们采用多重PCR及连接酶技术，将22种HPA基因型进行有效扩增。同时设计识别相应HPA基因片段上SNP位点的寡核苷酸探针，并将探针固定在微球上。然后将HPA扩增产物同包被探针的微球杂交，通过Bio-Plex悬浮芯片阅读仪判定22种HPA的基因型。

材料与方法

1 主要试剂和仪器 热启动Taq DNA聚合酶购自美国Qiagen公司，DNA 连接酶购自美国NEB公司，磁珠购自美国Bio-Rad公司，吗啉乙磺酸水合物购自美国Sigma公司，碳二亚胺盐酸盐购自美国Thermo Scientific公司， Gene Amp 9700 PCR扩增仪产自美国ABI公司，Bio-Plex 悬浮芯片仪产自美国Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 多重PCR扩增：根据GeneBank公布的各型HPA基因序列，在22个检测位点的两侧设计扩增引物，设计扩增片段的长度100～500bp。以人基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系总体积20μl，扩增条件为95℃变性3min，95℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 30s进行5个循环，95℃ 30s、 55℃ 30s、72℃ 30s再进行30个循环，72℃延伸1min。扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳25min，具体操作参见文献[1-2]。

2.2 连接反应：反应体系包括1× thermo stable ligase reaction buffer、多重PCR扩增产物1μl、连接探针0.2μM、thermo stable ligase 4U，反应总体积为20μl。连接反应条件为95℃变性3min，95℃ 30s、60℃ 30s共30个循环。

2.3 杂交反应：每孔加微球20μl、连接产物1.5μl，贴上封板纸并于振荡器上震荡10s。杂交反应条件为：94℃ 3min、50℃ 30min。反应结束后每孔加入荧光素80μl，50℃孵育10min。结果用Bio-Plex悬浮芯片阅读仪检测荧光信号。

2.4 聚合酶链反应-测序分型(PCR-SBT)：依照常规制备样品基因组DNA，经PCR后交由Genscript公司进行测序。

3 统计学方法 采用直接计数法，计算各型HPA-a、b的基因频率和基因型频率。

结 果

1 悬浮芯片分型方法的准确性分析 对100份献血者血液样品进行悬浮芯片HPA基因分型，其结果与被认为与金标准PCR-SBT分型结果完全一致。

2 悬浮芯片HPA分型结果 对313份西安市汉族献血者血液样品进行悬浮芯片HPA基因分型，分型结果见表1、2。

表1 悬浮芯片法检测西安市汉族献血者HPA基因型频率

注：HPA-7～14、16的分型结果均为aa型

表2 悬浮芯片法检测西安市汉族献血者HPA基因频率

讨 论

基因芯片技术以一种系统、整体的方法，研究生物体基因的表达及功能[3]。血小板输注是预防和治疗因血小板减少或功能异常而引发出血性疾病的重要手段。由于目前HPA分型技术的局限性，临床输注血小板时多考虑ABO血型，而忽视了HPA血型相配合的问题。HPA不配合可导致一系列临床同种免疫症状的出现，如新生儿同种免疫血小板减少症(NAIT)、输血后紫癜(PTP)及血小板输注无效(PTR)等。全面、准确、有效地检测HPA型别，开展HPA同型输注，以及建立已知HPA供者库，为患者提供相配合的血小板，对于促进临床血小板输注的安全性和有效性具有重要意义。

传统的血清学分型方法，由于缺乏质量高、特异性强的抗血清，加之部分患者较难采集到足够检测样品，使得HPA分型检测难以开展。由于22种HPA抗原的基因序列已完全清楚,应用基因分型检测成为可能。目前报道的基因分型方法有多种，包括聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针(ASO)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-直接测序分型(PCR-SBT)、基因芯片等[4-7]。目前这些方法虽有各自的优点，但大部分还难以做到高通量，即难以一次性完成HPA 22个型别的检测，也难以做到标准化判读结果。同时，现存大部分检测方法的准确性和特异性还有待进一步提高。这些因素障碍了临床HPA的分型检测和血小板同型输注。

悬浮芯片技术(Suspension array technology,SAT)是美国Luminex公司发明的新一代生物芯片技术。SAT既是后基因组时代科学研究的技术手段，又是新一代高通量分子诊断的技术平台。SAT系统主要由4种要素构成：微球、捕获分子(抗原、抗体或核酸探针)、待检分子、报告分子。微球主要用来固定和区分不同的捕获分子。利用100种有颜色差别的荧光编码微球，便可标记多达100种不同的探针分子，同时完成对一个标本多达100种的检测反应。包被于微球上的捕获分子既可为抗原和抗体，用于检测蛋白质，也可为核酸探针，用于检测核酸。将每种包被有相应捕获分子的荧光编码微球混悬于一个液相体系中，依次加入待检标本及报告分子，即构成了一个悬浮芯片反应系统。SAT的检测系统内置有双色激光发射器，产生的红色激光可将微球分类，从而区分不同的检测反应(定性作用)。产生的绿色激光用来激发报告分子上的绿色报告荧光，从而确定相应待检分子的数量(定量作用)。利用悬浮芯片系统，可以对同一微量标本中的多个不同待检分子同时进行快速的定性、定量分析。与其它检测方法特别是与所谓“金标准”的ELISA方法相比，液相芯片在特异性、敏感性、简易性、可靠性、多路性、成本及耗时7个方面均具有显著优势，对于要求高通量、准确、简便的HPA基因分型工作特别适用。

我们采用多重PCR及连接酶技术有效扩增22种HPA基因，将扩增产物与包被在荧光微球上的特异性探针杂交，通过Bio-Plex悬浮芯片阅读仪判定HPA基因型，检测结果与金标准方法PCR-SBT分型结果完全一致。我们真正建立了一种高通量、结果准确、操作简单的HPA基因分型方法，为大样本HPA分型检测以及建立已知HPA供者库提供了基石。

[1] 安群星，李翠莹，陈 蕤，等. 人类血小板抗原基因分型参考品的制备及鉴定[J]. 中国输血杂志,2011,24(5): 411-413.

[2] An QX,Li CY,Xu LJ,etal. High-throughput simultaneous genotyping of human platelet antigen-1 to -16 by using suspension array[J]. Transfusion,2013,53(11):2722-2728.

[3] 李兰芳，陈临溪.基因芯片及其医学应用研究进展[J].陕西医学杂志，2004，33(3)：241-245.

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[7] 杨 华，巨 蓉. 促红细胞生成素对缺氧缺血性脑病患儿血清NSE、S-100B水平的影响及作用机制研究[J]. 陕西医学杂志,2016,45(7):887-889.

*陕西省科技计划项目(2011K12-05-15)

△通讯作者

抗原，人血小板 @悬浮芯片 基因分型技术 微型芯片分析操作

R392

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.005

(收稿：2017-04-11)