冠状动脉痉挛相关基因NOS3同义突变位点鉴定研究*

霍建华，陈姝萍，卢 群，张 俊，白 玲，马爱群，刘 平Δ

1.西安交通大学第一附属医院心血管内科(西安710061)，2.陕西省镇安县中医院内二科(镇安711500)

冠状动脉痉挛相关基因NOS3同义突变位点鉴定研究*

霍建华1，陈姝萍1，卢 群1，张 俊2，白 玲1，马爱群1，刘 平1Δ

1.西安交通大学第一附属医院心血管内科(西安710061)，2.陕西省镇安县中医院内二科(镇安711500)

目的：研究中国人冠状动脉痉挛患者一氧化氮合酶(NOS3)基因突变位点。方法：采用聚合酶链反应对9例冠状动脉痉挛的患者NOS3基因全部27个外显子进行扩增，对PCR产物进行基因测序。结果：冠状动脉痉挛组中共有4例存在NOS3基因同一位点的同义突变，位于第17外显子的第1998核苷酸位点处的C突变为G(C1998G)，使第666位的密码子GCC变为GCG，所编码的氨基酸并未发生改变，仍为丙氨酸(A)，其中3例为杂合子(C/G)，1例为纯合子(G/G)，其余患者及健康人群组均未发现上述突变及已知突变。结论：冠状动脉痉挛患者中发现的NOS3基因同义突变位点(C1998G)可能与冠状动脉痉挛的发病相关。

冠状动脉痉挛(Coronary artery spasm,CAS)是指由于各种原因导致冠状动脉收缩，引起血管管腔暂时性不完全或完全闭塞，从而引起心肌缺血，产生心绞痛、心律失常、心肌梗死甚至猝死等的临床综合征。冠状动脉痉挛的发病机制比较复杂，目前主要发现它可能与血管内皮功能紊乱、血管活性物质平衡失调、血管平滑肌反应性增强、植物神经功能紊乱、氧化应激、慢性炎症反应、心理应激、行为方式及Mg2+或H+缺乏等因素有关，其确切机制仍然不明确[1]。

目前发现分子遗传学在冠状动脉痉挛中发挥作用，已有多项研究结果表明，基因突变可能参与了冠状动脉痉挛的发生。研究发现一氧化氮(NO)合成的减少在冠脉痉挛中起关键作用[2]。因此，NO在合成过程中的一些重要蛋白相关的基因存在突变等异常，导致其表达血管活性物质的水平改变，最终成为冠状动脉痉挛发生的病理生理机制之一。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)是冠状动脉内皮细胞合成NO过程中的关键酶。一氧化氮合酶(NOS3)基因编码eNOS，位于常染色体7q35-36，由27个外显子及26个内含子组成，启动子存在于5’侧翼区。目前已经发现NOS3突变Glu298Asp和单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)T786C与冠脉痉挛及其它心血管疾病具有相关性[3-4]。突变可引起eNOS结构的改变，从而使eNOS功能发生改变，最终导致NO合成与释放的含量减少，从而增加冠状动脉痉挛的发生。本研究旨在对发生冠脉痉挛的患者进行NOS3基因进行检测，以期发现是否有新的突变位点。

对象和方法

1 研究对象 选取2013年1月至2013年12月期间在西安交通大学第一附属医院心血管内科收治住院诊断为冠状动脉痉挛的患者9例(研究组)以及健康体检人群10例(对照组)。研究组入选标准：①临床上具有静息性胸闷或胸痛等症状特点；②症状发作时伴有心电图缺血改变，症状缓解后心电图随之恢复正常；③冠状动脉造影未见严重血管狭窄(<50%)或存在>50%狭窄但非罪犯血管。对照组：无任何胸闷、胸痛等症状，无高血压、糖尿病、冠心病等疾病史，年龄和性别构成与研究组基本匹配。

2 方 法

2.1 血标本的收集及处理及DNA提取：标本采自外周静脉血。每人采集约10ml，经EDTA抗凝后，-20℃保存。全血DNA提取：按照TIANGEN生化科技(北京)有限公司提供的血液基因组DNA提取试剂盒说明进行全血DNA提取。

2.2 PCR扩增:引物设计合成：通过NCBI Genebank查找h-NOS3基因的cDNA全序列，按照引物设计的原则，覆盖基因外显子及内含子-外显子交界区，将h-NOS3基因的27个外显子分为12个片段，将h-EDN1基因的5个外显子分为4个片段，分别设计每个片段的上游及下游引物；引物的合成由北京奥科生物技术有限公司完成。

2.3 PCR反应体系：以人基因组DNA为模板，PCR反应体系为50μl，各组分为：模板DNA 4μl，一对引物各2μl，2×Taq PCR MasterMix为25μl，ddH2O为17μl。

2.4 PCR反应循环的设置：94℃预变性3 min后，94℃变性30 s，50～60℃复性30 s，72℃延伸1 min，30个循环后72℃续延伸5 min。

2.5 琼脂糖凝胶电泳及摄影：分别取PCR产物各10μl，与2μl Loading Buffer混合后，加入琼脂糖凝胶的加样孔进行电泳，电泳结束后利用高灵敏度化学发光仪ChemiDoc XRS(美国BIO-RAD公司)进行摄影。

2.6 DNA测序及结果分析：将琼脂糖凝胶电泳得到目的条带的剩余PCR产物(每个片段40 μl)，纯化后进行直接DNA测序(纯化和测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成)。所得测序结果通过应用NCBI网站GenBank中BLAST程序与NOS3基因的cDNA全序列进行比对分析以确定突变位点。

结 果

冠脉痉挛患者PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳摄影照片显示各外显子条带清晰，第17号外显子所处条带大小为为985bp(图1)。基因检测结果提示两组均未发现Glu298Asp和T786C突变。但研究组中共有4例测序结果中存在同一位点的同义突变(C1998G)，该突变位于NOS3基因外显子第1998核苷酸位点处的C突变为G，该突变点处于第17号外显子，使第666位的密码子GCC变为GCG，所编码的氨基酸并未发生改变，仍为丙氨酸(A)。根据峰图可得到其中3例突变为杂合子(C/G)(图2a)，1例突变为纯合子(G/G)(图2b)。而对照组未发现突变(图2c)。

左侧箭头所指为DNA Ladder图像，上方箭头所指为第17外显子所在的片段图像，该片段大小为985bp

讨 论

eNOS是NO合成过程中的关键酶，因此当eNOS结构或功能受损时，则会影响NO的释放以及血管内皮细胞的功能，从而增加冠状动脉痉挛的发生风险。当eNOS基因即NOS3基因发生突变时，则可能改变cDNA的碱基组成，进一步使mRNA翻译后得到的蛋白质多肽链中的氨基酸顺序或组成发生改变，从而影响所表达的蛋白质的生物功能，主要包括同义突变、错义突变、无义突变等几种类型。基因突变可能通过以上机制而使eNOS的结构或功能发生异常，参与冠状动脉痉挛的发生。

本研究对NOS3基因共27个外显子基因筛查发现，在研究组冠状动脉痉挛患者中共有4例测序结果中存在同一位点的同义突变，即位于NOS3基因第17号外显子的第1998核苷酸位点处的C突变为G(C1998G)，使第666位的密码子GCC变为GCG，所编码的氨基酸并未发生改变，仍为丙氨酸(A)。其中3例突变为杂合子(C/G)，1例突变为纯合子(G/G)，提示C1998G突变可能与冠状动脉痉挛的发病相关。

A：突变DNA正向测序峰图(杂合子)；B：突变DNA正向测序峰图(纯合子)；C：健康患者DNA正向测序峰图(所指为突变点C→G；所指为突变位点对应的氨基酸仍为丙氨酸)

图2 突变DNA与正常DNA正向测序峰图

C1998G突变属于碱基置换突变，该突变对表达得到的多肽链中氨基酸序列的影响类型属于同义突变。同义突变(Synonymous mutation)是指当发生碱基置换之后，虽然产生了新的密码子，但是由于生物遗传密码子的简并性，使改变前、后的密码子属于同义密码子，所编码的氨基酸种类保持不变。传统观念认为因为同义突变并没有改变氨基酸的顺序或组成，所以不会影响所表达的蛋白质的结构或功能，因此不会产生突变效应而成为致病因素，而被称为沉默突变(Silent mutation)。近年来，随着越来越多的针对基因调控区、内含子等翻译区突变的研究，同义突变不会影响蛋白质的结构和功能这个传统观念已经逐渐转变。虽然同义突变不会引起氨基酸的一级结构，即氨基酸的种类或顺序，但在mRNA翻译合成蛋白质的过程中，由于每种密码子使用的tRNA不同，而细胞内各种tRNA的含量是不相同的，进而影响到核糖体的工作效率，使同一种氨基酸对各个简并密码子的翻译效率产生差异，或转录的水平不完全相同，从而可以导致蛋白质表达水平的改变[5]。另外，同义突变可以通过改变mRNA的构象，从而降低mRNA的稳定性及核糖体的翻译效率，或者通过减慢密码子翻译氨基酸序列的速度，而影响多肽链的三维折叠及修饰加工的过程，最终可能使蛋白质的结构或功能[6]。所以C1998G突变可能与冠状动脉痉挛的发病关系密切。

[1] 霍 旺,李绍旦,王 朋,等. 冠状动脉痉挛机制研究概况[J]. 解放军医学院学报,2013,(2): 183-185.

[2] Vecoli C. Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms in cardiovascular disease[J]. Vitam Horm,2014,96: 387-406.

[3] Zhang C,Lopez-Ridaura R,Hunter DJ,etal. Common variants of the endothelial nitric oxide synthase gene and the risk of coronary heart disease among U.S. diabetic men[J]. Diabetes,2006,55 (7): 2140-2147.

[4] De Marco KC,Braga GU,Barbosa F. Determination of the effects of eNOS gene polymorphisms (T-786C and Glu298Asp) on nitric oxide levels in a methylmercury-exposed population[J]. Journal of Toxicology and Environmental Health Part A,2011,74 (20): 1323-1333.

[5] Moura GR,Pinheiro M,Freitas A,etal. Species-specific codon context rules unveil non-neutrality effects of synonymous mutations[J]. PLoS One,2011,6(10):e26817.

[6] Rudolph KL,Schmitt BM,Villar D,etal. Codon-driven translational efficiency is stable across diverse mammalian cell states[J]. PLoS Genet,2016,12(5): e1006024.

MutationsofNOS3geneincoronaryarteryspasm

Huo Jianhua,Chen Shuping,Lu Qun,et al.

Department of Cardiovascular Medicine, the First Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Objective: To study the mutation of NOS3 gene among the patients with coronary artery spasm. Methods: 9 coronary artery spasm patients and 10 healthy control were included in the present study. Peripheral blood was sampled and genomic DNA was extracted,polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing was used to screen all the 27 exons of NOS3 gene. Results: A novel synonymous mutation was found in the NOS3 gene of 4 patients,which was located in the 1998 site of the 17thexon (C1998G). 3 of them were C/G heterozygous mutation and 1 of them was G/G homozygous mutation. Conclusions: A novel synonymous mutation (C1998G) is found in the NOS3 gene of 4 patients,which may be correlated with coronary artery spasm.

Coronary vasospasm/physiopathology Nitric oxide synthase typeⅢ/analysis Mutation

*国家自然科学基金资助项目(30801133)

陕西省自然科学基础研究计划项目(2014JM2-8154)

△通讯作者

冠状血管痉挛/病理生理学 一氧化氮合酶Ⅲ型/分析 突变

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.003

(收稿：2017-04-17)