两株芽孢杆菌联合发酵黄芪对育雏蛋鸡免疫机能的影响

王丽荣，陈 雷，孙明杰，陈 静，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安 271000）

两株芽孢杆菌联合发酵黄芪对育雏蛋鸡免疫机能的影响

王丽荣，陈 雷，孙明杰，陈 静，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安 271000）

为优化解淀粉芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌发酵黄芪条件，并研究黄芪发酵制剂对育雏蛋鸡免疫机能的影响。本试验以菌体生物量及黄芪多糖增率为指标，通过培养时间、温度及pH进行优化，获得芽孢杆菌发酵黄芪的最佳条件，再将发酵制剂以不同的剂量添加至蛋鸡饲料中，研究其对育雏蛋鸡免疫机能的影响。结果显示：最优发酵条件为初始pH 5.0，培养温度36℃，培养时间28 h，接种黄芪质量分数8%；蛋鸡35、42日龄时，3‰发酵黄芪组的脾脏指数比对照组分别提高40.7%、36.7%（P＜0.05）；添加未发酵黄芪组脾脏指数与对照组差异不显著（P>0.05），与3‰发酵黄芪组差异显著（P＜0.05）；法氏囊指数在蛋鸡35日龄时，3‰发酵黄芪组比对照组和未发酵黄芪组分别提高24.8%和22.37%（P＜0.05）；3‰发酵黄芪组可显著提高蛋鸡血清中免疫球蛋白的含量（P＜0.05）；35、42日龄时，3‰发酵黄芪组的IgG含量比对照组分别提高12.3%、14.5%（P＜0.05）。研究表明，芽孢杆菌发酵黄芪制剂，能够提高育雏蛋鸡的免疫机能。

芽孢杆菌；黄芪；发酵；育雏蛋鸡；免疫功能

黄芪属豆科植物，又名黄耆，味干、性温，集补气与食疗的药食两用功效于一体，是我国传统的中草药之一。黄芪含黄芪多糖（APS）、生物碱、黄酮、叶酸以及多种微量元素，具有较强的抗氧化作用（杨五彪等，2005），其中黄芪多糖是近年来研究和开发的热点（单体中等，2006）。

研究表明，地衣芽孢杆菌可以通过促进肠道优势菌群的生长而提高营养物质的消化和吸收，具有明显的促生长作用和降低料重比的功能 （郝生宏，2008；Abdulrahim，1999）。 芽孢杆菌发酵在一定程度上会对中草药成分进行利用和转化，促使营养物质释放出来，并能消除中草药中的抗营养因子，同时中草药中的某些成分可促进或抑制代谢产物的产生，减少对动物消化利用的障碍。研究表明，发酵黄芪可以提高动物体免疫球蛋白的含量（韩宇，2012；Ducle，2004）。近年来，黄芪以其出众的免疫调节功效赢得越来越多的关注。

本研究旨在优化解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌联合发酵黄芪条件及发酵制剂对蛋鸡免疫机能的影响，为黄芪发酵制剂在蛋鸡生产中的应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 中草药 黄芪，购于山东省泰安市龙潭大药房。

1.1.2 菌株 解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0065（水8）、地衣芽孢杆菌 BLCC1-0014（dy7），均由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院菌种保藏中心保藏。

1.1.3 培养基 芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、酵母膏0.5%、pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌 20 min，固体培养基需要加入1.5%琼脂粉。上述百分数均为质量分数。

1.1.4 试验动物 选用1日龄海兰褐健康蛋公鸡150羽（购自泰安市东岳种禽有限公司），按照常规程序免疫后进行试验，基础日粮组成及营养水平见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 芽孢杆菌发酵黄芪条件的优化 菌株发酵条件的优化，包括黄芪质量浓度、培养时间、培养基温度、培养pH。

1.2.1.1黄芪质量浓度优化 在无菌条件下，将芽孢杆菌种子液分别按照体积比2%的接种量，分别接入质量分数为 4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%、16.0%的黄芪水溶液中，37℃，220 r/min振荡培养24 h。采用芽孢杆菌活菌数、黄芪多糖增率进行黄芪质量浓度的筛选确定。

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

1.2.1.2 培养时间优化 在无菌条件下，将芽孢杆菌种子液分别按照体积比2%的接种量，分别接入到由1.2.1.1得出的黄芪质量浓度培养基中，37℃，220 r/min 振荡培养 20、24、28、32、36、40 h。 采用芽孢杆菌活菌数、黄芪多糖增率进行培养时间的筛选确定。

1.2.1.3 培养温度优化 在无菌条件下，将芽孢杆菌种子液分别按照体积比2%的接种量，分别接入到由1.2.1.1得出的黄芪质量浓度培养基中，按照1.2.1.2得出的培养时间，分别置于30、33、37、40、43℃，220 r/min振荡培养。采用芽孢杆菌活菌数、黄芪多糖增率进行培养温度的筛选确定。

1.2.1.4 培养pH优化 在无菌条件下，将芽孢杆菌种子液分别按照体积比2%的接种量，分别接入到1.2.1.1得出的黄芪质量浓度培养基中，用0.5N NaOH和0.5N HCL将培养基pH分别调为5、5.5、6、6.5、7， 按照 1.2.1.2 得出的最佳培养时间、1.2.1.3得出的培养温度，220 r/min振荡培养。采用芽孢杆菌活菌数、黄芪多糖增率进行培养pH的筛选确定。

1.2.2 发酵黄芪对育雏蛋鸡影响试验

1.2.2.1 试验设计 将150只1日龄海兰褐蛋鸡随机分成5组，分别为对照组CK（饲喂基础日粮）、试验Ⅰ组（基础日粮添加0.5‰的发酵黄芪粉剂）、试验Ⅱ组（基础日粮添加1‰的发酵黄芪粉剂）、试验Ⅲ组（基础日粮添加3‰的发酵黄芪粉剂）和试验Ⅳ组（基础日粮添加3‰的未发酵黄芪粉剂），每组3个平行，预饲1周后，连续7 d饲喂添加相应添加剂的饲料。

1.2.2.2 饲料制备 购买成品蛋鸡饲料后磨碎，分别加入相应剂量添加剂后重新制粒。

1.2.2.3 免疫器官指数测定 分别于 28、35、42日龄称重后处死鸡只，立即取出脾脏和法氏囊，用滤纸吸干血液后称重。

脾脏（法氏囊）指数/（mg/g）=脾脏（法氏囊）重量/鸡体重。

1.2.2.4 免疫因子的检测 杀鸡后取血，将血液静置离心后，获得血清，测IgG指标，具体按照鸡IgG ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行，试剂盒购于北京鑫方程生物科技有限公司。

1.3 数据分析 试验结果均以“平均值±标准差”表示，数据应用SPSS 13.0统计分析软件进行单因素方差分析和多重比较。

2 试验结果

2.1 黄芪浓度对芽孢杆菌活菌数及多糖增率的影响 由表2可知，当芽孢杆菌水8、dy7在黄芪质量浓度为8%时，黄芪多糖增率最高 （且为正值），随着黄芪质量浓度的增加，其黏度亦变大，且两株芽孢菌活菌数均较高，故确定黄芪质量浓度8%为最佳发酵浓度。

表2 黄芪浓度对芽孢杆菌活菌数及多糖增率的影响

2.2 培养时间对芽孢杆菌活菌数及多糖增率的影响 由表3可知，在黄芪质量浓度8%条件下，发酵时间28 h，芽孢杆菌水8、dy7的活菌数最高，且多糖增率降低较少，故确定发酵时间28 h为最佳培养时间。

2.3 培养温度对芽孢杆菌活菌数及多糖增率的影响 由表4可知，在黄芪质量浓度为8%、发酵时间28 h条件下，培养温度为36℃时，芽孢杆菌水8、dy7的活菌数最高且多糖增率较高，故确定培养温度36℃为最佳培养温度。

表3 培养时间对芽孢杆菌活菌数及多糖增率的影响

表4 培养温度对芽孢杆菌活菌数及多糖增率的影响

2.4 pH对芽孢杆菌活菌数及多糖增率的影响由表5可知，在黄芪浓度为8%，发酵时间28 h，培养温度36℃条件下，pH为5.0时，芽孢杆菌水8、dy7的活菌数最高且多糖增率较高，故确定pH 5.0为最佳培养pH。

表5 pH对芽孢杆菌活菌数及多糖增率的影响

2.5 发酵黄芪制剂对海兰褐蛋鸡脾脏指数的影响 从表6可以看出，与对照组CK相比，试验Ⅲ组脾脏指数在28、35、42日龄分别提高47.02%、40.7%、36.7%（P＜0.05）；试验Ⅳ组脾脏指数在28、35、42日龄分别比对照组提高27.15%、8.94%、4.59%（P＞0.05）；试验Ⅲ组的脾脏指数在28、42日龄比试验Ⅳ组分别提高15.63%和30.70%（P＜0.05），说明发酵黄芪在提高脾脏指数方面试验Ⅲ组效果较好。

表6 发酵黄芪对蛋鸡脾脏指数的影响mg/g

2.6 发酵黄芪制剂对海兰褐蛋鸡法氏囊指数的影响 从表7可以看出，试验Ⅱ组及试验Ⅲ组法氏囊指数在35、42日龄分别比对照组提高12.08%、20.09%和24.83%、37.22%（P＜0.05）。 试验Ⅳ组法氏囊指数与对照组相比差异不显著（P＞0.05），试验Ⅱ组及试验Ⅲ组法氏囊指数在35日龄分别比试验Ⅳ组高9.87%和22.37%（P＜0.05）。说明发酵黄芪在提高法氏囊指数方面较未发酵黄芪效果较好，其中发酵黄芪Ⅲ组效果最好。

表7 发酵黄芪对蛋鸡法氏囊指数的影响mg/g

2.7 发酵黄芪制剂对海兰褐蛋鸡血清IgG的影响 从表8可以看出，试验Ⅲ组蛋鸡血清中免疫球蛋白的含量显著提高（P＜0.05），其中35日龄时，试验Ⅲ组的IgG含量比对照组显著提高12.3%；42日龄时，试验Ⅲ组的IgG含量比对照组显著提高14.5%。试验Ⅳ组IgG含量与对照组差异不显著（P＞0.05），略差于发酵黄芪组，说明在提高免疫球蛋白方面，发酵黄芪组优于未发酵黄芪组。

表8 发酵黄芪对蛋鸡血清IgG的影响

3 讨论

3.1 发酵黄芪制剂对海兰褐蛋鸡免疫器官指数的影响 脾脏是鸡体内最大的外周免疫器官，法氏囊是禽类B淋巴细胞发育成熟的器官，两者参与全身的体液免疫和细胞免疫，器官指数的增加表明机体的免疫机能提高。脾脏、法氏囊指数可以用来评价雏鸡的免疫水平和状况。黄芪多糖能够增强免疫器官和细胞的功能，还能刺激细胞因子的释放，影响神经-内分泌-免疫系统网络，促进相关基因的合成和表达（陆新浩等，2008）。研究表明，黄芪多糖能够作用于多种免疫器官，增加器官质量，提高脏器指数，还能够促进部分脏器的发育。单俊杰等（2000）研究发现，补充黄芪多糖能提高小鼠胸腺的质量。胡晓燕（2011）在对运动性免疫抑制调理研究中发现，黄芪多糖能拮抗递增负荷训练大鼠的胸腺萎缩。安松兰（2007）用不同剂量的黄芪多糖刺激环磷酰胺处理的小鼠，结果表明，脾脏及胸腺指数均有增加；此外黄芪多糖还能促进鸡法氏囊和脾脏的发育。

本试验结果发现，试验Ⅲ组（3‰发酵黄芪组）海兰褐蛋鸡脾脏、法氏囊指数显著提高，其中35日龄时，试验Ⅲ组（3‰发酵黄芪组）的脾脏指数比对照组显著提高40.7%；试验Ⅲ组（3‰发酵黄芪组）的法氏囊指数比对照组显著提高24.8%。这说明3‰添加量的发酵黄芪制剂能提高海兰褐蛋鸡的免疫水平。

3.2 发酵黄芪制剂对海兰褐蛋鸡血清IgG的影响 IgG为体液内主要的免疫球蛋白，约占血液中免疫球蛋白总量的70%～75%，在免疫应答中可激活补体，中和多种毒素，并且在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物中和细菌毒素方面具有重要作用。项杰（2007）研究表明，给感染李斯特菌的小鼠注射黄芪多糖，其血清中IgG浓度显著提高，说明黄芪多糖可以促进B细胞的活化和增殖，增强宿主的体液免疫和细胞免疫来保护宿主抵抗病原菌的感染。另外，黄芪中的多糖成分还可以诱导干扰素的产生和参与免疫调节 （邓曼，2007）。王志祥等 （2006）在肉仔鸡日粮中添加0.2%或0.3%的黄芪提取物发现，肉仔鸡日增重和饲料转化率、肉仔鸡的胸腺指数、法氏囊指数和脾脏指数显著提高，血清丙二醛含量降低。黄芪中多糖成分可以提高鸡传染性法氏囊、禽流感疫苗的免疫效果，提高抗体水平，增强对病侵袭的抵抗力（陆新浩等，2008；王旭贞等，2007）。杨松等（2012）在禽流感免疫期间给肉鸡口服黄芪多糖，以研究黄芪多糖对禽流感疫苗免疫效果的影响，结果表明，在一定范围内高剂量和低剂量的黄芪多糖均能提高AI血凝抑制试验抗体的效价，并且可以提高肉鸡的免疫器官指数和生产性能。

本研究中，在蛋鸡35、42日龄时，试验Ⅲ组蛋鸡血清中免疫球蛋白与对照组、其他试验组相比均显著增加，表明3‰添加量的发酵黄芪制剂可显著提高蛋鸡的免疫水平，增强动物疾病抵抗力。

4 结论

4.1 本试验结果显示，在黄芪质量浓度为8%、发酵时间为28 h、温度36℃、pH为5.0时，解淀粉芽孢杆菌水8（BLCC1-0065）和地衣芽孢杆菌dy7（BLCC1-0014）两株芽孢杆菌的活菌数与多糖增率均较高。

4.2 日粮中添加发酵黄芪制剂饲喂蛋鸡后，能够显著提高蛋鸡的免疫器官重量，对体液免疫也起到了一定的促进作用，其中以3‰添加量的发酵黄芪制剂组效果最优。

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This study was to optimize the fermentation conditions of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus licheniformis，to study the effect of Astragalus membranaceus fermentation preparation on immune function of brooding-laying hens.At first，the fermentation conditions for Astragalus membranaceus including incubation time，temperature and pH were explored to determine the optimal fermentation process，and the biomass and the increasing rate of Astragalus polysaccharides were taken as the indexes of evaluation.Then different dosages of fermented preparations were added into layer feed to evaluate the effect of immune function on brooding-laying hens.The results showed that the optimum fermentation conditions were initial pH 5.0，culture temperature 36 ℃，incubation time 28 h，inoculation of Astragalus mongholicus 8%.The spleen index of 3‰fermented Astragalus membranaceus group were 40.7%and 36.7%higher than that of the control group at the age of 35 and 42 days respectively.There was no significant difference in spleen index between the unleavened Astragalus group and the control group （P ＞ 0.05），which was significantly different from that of the 3‰ Astragalus membranaceus fermentation group（P ＜0.05）.The index of bursa of 3‰ fermented Astragalus membranaceus group were increased 24.8%and 22.37%compared with the control group and the unleavened Astragalus group at 35 days old （P ＜ 0.05）.The content of immunoglobulin in serum was significantly increased in 3‰ Astragalus membranaceus group （P ＜ 0.05）.The content of IgG in the 3‰fermented Astragalus membranaceus group were 12.3%and 14.5%higher than that of the control group at 35 and 42 days old，respectively （P ＜ 0.05）.In conclusion that the fermentation of Astragalus membranaceus could improve the immune function of brooding-laying hens.

Bacillus；Astragalus membranaceus；fermentation；brooding-laying hens；immune function

S816.6

A

1004-3314（2017）20-0014-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172004

2013年泰安市科技发展计划-社会发展领域关键技术研究与示范“饲用黄芪多糖的研制”（201340629）