芦荟提取物对脂多糖诱导的人牙周膜细胞炎性反应的抑制作用

张双 高鹰 李黎仙 杜俊蓉

芦荟提取物对脂多糖诱导的人牙周膜细胞炎性反应的抑制作用

张双 高鹰 李黎仙 杜俊蓉

目的探讨芦荟(AVE)提取物对脂多糖(LPS)诱导人牙周膜细胞(hPDLCs)炎性反应的作用。方法将hPDLCs分为对照组，模型组(1 μg/ml LPS)和AVE组，浓度为0.05，0.1， 0.2 mg/ml的AVE分别处理AVE组的hPDLCs； MTT法测定各组细胞存活率； ELISA法检测细胞上清中IL-6含量；用免疫细胞化学染色检测TLR4的表达情况；免疫荧光染色检测NF-κB-p65的核转情况。结果各组细胞存活率差异没有显著性，模型组上清液中的IL-6含量显著升高， TLR4表达及 NF-κB-p65的核转均明显上调；与模型组相比，芦荟提取物呈剂量依赖性抑制细胞上清液中IL-6的分泌，下调TLR4表达及NF-κB-p65的核转移。结论芦荟提取物能有效抑制人牙周膜细胞的炎症反应，其机制与TLR4/NF-κB-p65信号通路有关。

芦荟提取物(AVE)； 人牙周膜细胞(hPDLCs)； 脂多糖(LPS)

牙周炎是细菌引起的慢性炎症，往往引发牙周支持组织的炎性破坏。人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)免疫应答是牙周组织结构完整或者破坏的重要决定因素[1]。牙周炎主要是由革兰氏阴性菌引起的[2-3]，而脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。Toll 样受体(Toll like receptors, TLRs)是一类天然免疫受体，TLR4是其主要成员之一，研究表明hPDLCs被 LPS 刺激后，经一系列信号转导，激活细胞核转录因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)从而调节各种炎症因子的表达[4]，参与牙周组织破坏。因此如何调控hPDLCs炎症反应的发生，对牙周炎的防治具有重要意义。

芦荟为百合科芦荟属多年生肉质草本植物，集食用、药用、美容、观赏于一身。文献报道，该植物具有抗炎、促进伤口愈合、增强免疫功能、降血糖等多种药理活性[5-6]。目前，芦荟提取物对牙周炎的防治作用鲜有报道，本研究从细胞水平探讨芦荟提取物对LPS诱 导下的hPDLCs炎症的抑制作用并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与药物来源

1.2 主要仪器与试剂

LPS(E.coliO55:B5，Sigma，美国)；IL-6 Elisa试剂盒(北京达科为生物技术有限公司)；α-MEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(民海生物)；DMSO，MTT(Amresco，美国)；兔抗TLR4单克隆抗体、羊抗兔FITC、抗荧光衰减封片剂、4, 6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色剂、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)；羊抗兔NF-κB p65单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；倒置式生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)；酶标仪(Bio-RAD Model 550,美国)；显微镜及照片获取系统(Olympus，日本)。

1.3 细胞培养

将冻存的hPDLCs复苏，用含10%胎牛血清和1%青霉素、1%链霉素的α-MEM培养基，在37 ℃、5%CO2孵箱中进行培养， 1∶3比例进行传代，选取4～6 代细胞用于实验。

1.4 实验分组

实验分为5组，包括对照组，模型组(1 μg/ml LPS)，芦荟提取物低剂量组(0.05 mg/ml)，中剂量组(0.1 mg/ml)，高剂量组(0.2 mg/ml)。

1.5 MTT法检测细胞活性

从DDoS攻击的发展历程，我们不难看出，在如今这个虚拟网络已经嵌入我们现实生活的社会里，DDoS攻击无疑是一个巨大的安全隐患。伴随着DDoS工具的廉价性、易获取性，以及各僵尸网络家族的快速增长，利用物联网设备组建僵尸网络发起攻击的现象日益严峻，与此同时，移动端的僵尸网络亦处于萌芽阶段，网络安全之路可谓任重道远。

将对数生长期的hPDLCs(1×105/ml) 接种于96 孔板，于37 ℃、 5% CO2培养箱中培养24 h，按各组浓度进行造模或给药，每组3 个复孔，继续培养24 h后，每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT，继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μl DMSO，常温下摇床摇10 min，在酶标仪490 nm 波长测吸光度值，取3 孔平均值，计算细胞存活率(实验组A490/空白组A490×100%)。重复3 次。

1.6 ELISA法检测IL-6的含量

将对数生长期的hPDLCs(1×105/ml) 接种于96 孔板，于37 ℃、 5% CO2培养箱中培养24 h，按照各组浓度预防给药1 h， 1 μg/ml LPS造模作用24 h， 每组9 个复孔，收集培养上清，根据Elisa试剂盒说明书测定细胞上清液中IL-6含量。

1.7 免疫染色法测定TLR4的表达

将对数生长期的hPDLCs(3×104/ml) 接种24 孔板爬片，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，取对照组、模型组、高剂量组，预防给药1 h，每组3 个复孔，1 μg/ml LPS造模作用24 h后，SABC免疫细胞染色法进行DAB染色，苏木素染核，脱水透明后，中性树脂封片，光学显微镜下观察TLR4表达情况。

1.8 免疫荧光染色法检测NF-κB-p65的核转状况

将对数生长期的hPDLCs(3×104/ml)接种24 孔板爬片，于37 ℃、 5% CO2培养箱中培养24 h，取高剂量组预防给药1 h。 1 μg/ml LPS造模1 h后， PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min， PBS洗3 次，1 min/次，0.3% Triton X-100打孔30 min，PBS漂洗3 次， 1 min/次，3% H2O230 min氧化内源性过氧化物酶， PBS洗3 次，1 min/次，5% 牛血清 37 ℃封闭1 h，一抗(1∶50)4 ℃过夜，PBS洗3 次，荧光二抗37 ℃避光孵育1 h， DAPI染核1 min，抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察NF-κB-p65的表达情况。每组3 个复孔。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 芦荟提取物对hPDLCs细胞活性的影响

与对照组比较，模型组、芦荟提取物低、中、高剂量组中细胞活力无显著差异(P>0.05, 表 1)。

注： 与对照组比较, ①P>0.05

2.2 芦荟提取物对细胞上清液中IL-6 含量的影响

与正常组比较，模型组中IL-6含量显著提高(P<0.05)。与模型组比较，芦荟提取物低、中、高剂量组hPDLCs细胞上清中IL-6 含量均显著下降(P<0.05)，并且呈剂量依赖性(表 2)。

注： 与模型组比较, ①P<0.01， ②P<0.05

2.3 芦荟提取物对LPS诱导的hPDLCs中TLR4蛋白的影响

与对照组相比，模型组的TLR4阳性表达明显上调。与模型组相比，芦荟提取物高剂量组TLR4阳性表达颜色明显变浅，表达下调(图 1)。

2.4 芦荟提取物对NF-κB-p65的作用

对照组NF-κB-p65基本分布在胞浆中，模型组NF-κB-p65核转明显增多，芦荟提取物高剂量组NF-κB-p65的核转明显减少(图 2)。

3 讨 论

牙周炎是常见的口腔感染性疾病，已成为突出的口腔保健问题。 据报道， 芦荟具有抗炎作用[5]， 本研究就芦荟提取物对LPS诱导hPDLCs炎症的抑制效果进行了探讨。研究结果表明，芦荟提取物能够抑制LPS诱导hPDLCs分泌IL-6，其抗炎机制可能与抑制TLR-4介导的NF-κB信号通路有关，提示芦荟提取物可能是牙周疾病预防与治疗的有效药物。

A: 对照组； B: 模型组； C: 高剂量组

图 1 芦荟提取物对牙周膜细胞TLR4表达的影响 (×200)

A: Control group; B: Model group; C: AVE of 0.2 mg/ml

Fig 1 The effects of AVE on TLR4 expression in LPS-induced hPDLCs (×200)

图 2 芦荟提取物对LPS诱导牙周膜细胞NF-κB-p65核内转的作用 (×400)

Fig 2 The effects of AVE on the transfer of NF-κB-p65 into the nucleus in LPS-induced hPDLCs (×400)

hPDLCs在牙周炎的发生及发展过程中发挥着重要作用[1]。牙周炎的主要致炎因子LPS能促进如IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，参与牙周组织的破坏。因此，抑制炎症因子的产生有益于减缓牙周疾病的发展进程[7]。IL-6具有多种生物学效应，在牙周疾病中参与局部炎症反应及牙周组织的破坏。研究表明，IL-6不仅在牙周组织中能够诱导破骨细胞的生成[8]，还与牙周袋的深度密切相关[9]。牙周炎患者龈沟液中IL-6的含量显著高于健康人龈沟液中IL-6的含量，表明IL-6在某种程度上是牙周炎的严重程度的重要标志[10]。本研究中，芦荟提取物对LPS诱导hPDLCs分泌IL-6有明显的抑制作用，并呈剂量依赖性。这些结果提示，芦荟提取物对LPS诱导的hPDLCs的炎症反应有较好的抗炎效果。

TLR4是LPS的主要受体，二者结合后，通过相关信号转导激活NF-κB，从而诱发一系列炎症因子如IL-1β、IL-6等的产生[3]。正常状态下，NF-κB-p65在胞浆中与 NF-κB 抑制蛋白(Inhibitor of NF-κB，IκB)相结合[11]，处于非活化状态。在LPS刺激下，TLR4与髓样分化因子88结合，活化后的髓样分化因子88使得IL-1受体相关激酶发生一系列磷酸化反应[12]，IκB 磷酸化后，与NF-κB-p65形成的蛋白复合体解离，游离的 NF-κB-p65 进入细胞核，与相关位点的DNA链结合，从而发挥其调节转录功能[13-14]，调节多种炎症介质和细胞因子的表达，引起一系列炎症因子产生，促进牙周病的发生和发展。本实验探究了芦荟提取物对LPS诱导下hPDLCs中TLR4及NF-κB-p65的影响，结果显示库拉索芦荟凝胶冻干粉能够抑制LPS诱导的TLR4蛋白的表达以及NF-κB-p65的核转，进而抑制下游靶基因IL-6的生成。

综上所述，本研究选用的芦荟提取物对LPS诱导的hPDLCs炎症反应有一定抑制效应，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB通路有关。但值得注意的是，在本课题组同步进行的LPS诱导人牙龈成纤维细胞炎症反应研究中，芦荟提取物并没有抗炎活性(组内结果)。为何库拉索芦荟凝胶冻干粉对hPDLCs和人牙龈成纤维细胞炎症反应的影响有明显差异，值得进一步深入研究以阐明其药理学机制，为芦荟提取物在口腔保健产品中的合理应用提供可靠的实验依据。

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Theinhibitoryeffectsofaloeveraextractonlipopolysaccharide-inducedinflammatoryresponseinhumanperiodontalligamentcells

ZHANGShuang1,GAOYing2,LILixian2,DUJunrong1.

1. 610041Chengdu,DepartmentofPharmacology，WestChinaCollegeofPharmacy,SichuanUniversity,China; 2.YunnanBaiyaoGroupCo.,Ltd,Kunming

Objective: To explore the effects of aloe vera extra(AVE) on lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammatory response of human periodontal ligament cells(hPDLCs).MethodshPDLCs were induced with LPS at 1 μg/ml for the simulation of periodontitis model(model group) and then treated by AVE at 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml respectively(AVE group). Cell viability was examined by MTT assay. The level of interleukin-6(IL-6) from cell culture medium was measured by ELISA. The expression of Toll like receptor 4(TLR4) protein was detected by immunocytochemistry staining and the transfer of nuclear factor-kappa B p65(NF-κB-p65) was observed by immunofluorescence staining.ResultsThere was no significant difference of the cell viabilities among the groups. IL-6 in culture medium, the expression of TLR4 protein and the transfer of NF-κB-p65 into the nucleus were increased in model group. AVE at 0.05-0.2 mg/ml inhibited the secretion of IL-6 in the cell culture supernatant down-regulated the TLR4 expression, attenuated the transfer of NF-κB-p65 into the nucleus in a concentration-dependent manner.ConclusionAloe vera extract can inhibit the inflammation response of hPDLCs induced by LPS through TLR4/ NF-κB-p65 signaling pathway.

Aloeveraextract(AVE);Humanperiodontalligamentcells(hPDLCs);Lipopolysaccharide(LPS)

610041, 四川大学华西药学院药理学系(张双 杜俊蓉)； 云南白药集团股份有限公司(高鹰 李黎仙 )

杜俊蓉 E-mail： dujr_1@163.com

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.020

(收稿： 2016-10-18 修回： 2016-12-19)