铜绿微囊藻水华聚集对黑麦草生理生态的影响

邱颖　张琼　张雪　李石晶　孙靖

摘要：指出了蓝藻水华聚集引起水体环境恶化，人们可利用生物浮床来净化此类水体，黑麦草是供选择的浮床生物之一。在实验室中模拟生态浮床，探索了5种不同初始浓度的铜绿微囊藻接种后，生长于浮床上的黑麦草的生长情况及其生理响应，并比较了水体净化效果。结果表明：接种处理组的黑麦草的根长、鲜重与空白相比，都呈现增加趋势，但当蓝藻初始接种量达0.278 g/L时，生长情况较其他接种组变差；黑麦草叶片可溶性蛋白、MDA含量在大部分接种组都增加。此外，不接种蓝藻时，黑麦草能十分有效吸收水中的磷；初始接种量低于0.248 g/L时，随着接种量的增加，水体的TP 降低了78%～92%，CODCr却不断升高；超过0.248 g/L的接种处理组中，实验期间TP 减少率超过90%，但CODCr达到最大值。因此，在利用黑麦草净化富营养水体时，为更好地发挥其水体净化功能，应将种植时间提前，避免蓝藻水华的严重聚集。

关键词：水华聚集；铜绿微囊藻；黑麦草；丙二醛（MDA）；总磷（TP）

中图分类号：X524

文献标识码：A文章编号：16749944（2017）20002904

1引言

由于工农业的快速发展，城镇人口的增加，生活污水和工业废水未经处理而大量排放，水体中过量累积氮磷等营养盐而导致水体富营养化[1]。湖泊等水体富营养化最显著的外在特征之一就是浮游藻类的大量繁殖和蓝绿藻水华的频发。当前，世界范围内有30%～40% 的湖泊和水库，正遭受不同程度的富营养化影响；在我国，湖泊、水库富营养化及蓝藻爆发现象也愈加明显[2]。一项调查发现：我国处于富营养状态的水库个数、库容个数分别占所调查水库的30.8% 和11.2%[3]。

由于蓝藻爆发对水体及水中各类生物都会产生危害，人们一直在不断的探索对富营养水体的治理办法，植物修复是重要的治理方法之一。国外用于废水净化的植物较多，如常见的芦苇、香蒲和灯芯草等，凤眼莲、黑三棱、水葱等植物也有所使用[4]。我国净水植物品种的运用，大多参照国外的方式[5]。近年来，国内学者通过对沉水草本、漂浮草本、浮水草本、挺水草本、湿生草本、中生草本植物的大量研究，为废水净化选取了高性能的植物品种[6]。因此，利用生物浮床净化富营养水体这一研究领域有着较好的发展前景。在浮床生物的选择中，黑麦草因其产地广泛，培养简单方便，渐渐受到人们的重视并展开了一些污染水体修复方面的探索[7]。然而，针对富营养水体，黑麦草是否也具有净化效果？水华大量聚集后，将对黑麦草生长产生何种影响？蓝绿藻细胞死亡分解后对水体水质、营养盐释放以及黑麦草生长将产生何种影响？目前相关的报道尚不多见。

本实验将在室温下，以接种了不同浓度铜绿微囊藻的培养基作为培养介质，选用黑麦草作为浮床生物，探索蓝藻对黑麦草生理生化的影响，并分析培养介质中总磷（TP）和COD等净水指标的变化。本研究将为减轻蓝藻水华聚集，减少蓝藻对净水的浮床植物的不良影响，提高水体净化效果提供理论依据。

2实验方法

2.1铜绿微囊藻的培养与黑麦草的种植

本实验所用铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）购自中国科学研究院水生生态所淡水藻种库（湖北，武汉，FACHB-905），所用培养基为现配并灭菌的BG11蓝藻培养基（pH值为8.0）。藻种需经过几次转接来适应新环境，具体做法为：订购的藻种摇匀后，在无菌操作下直接转入小三角瓶内，用四层灭菌纱布把瓶口封好，防止污染并保持气体流通，然后放置在培养箱中培养2～3 d（培养箱光暗周期为14 h∶10 h，温度26±1 ℃，光照强度为2000 lx）；接着，在无菌操作下取5～10 mL藻样转入10～20 mL新鲜培养基中扩大培养；当铜绿微囊藻生物量明显增多时，再次转接，转接比例1∶5（藻液∶培养基），每天摇瓶3次。实验时选用的Microcystis aeruginosa为重新接种后生长3～4 d的新鲜藻样。

北方生黑麦草（Lolium perenne），购自巨丰种业（江苏，南京）。将黑麦草种子浸泡后，选出籽实饱满的种子，均匀撒入备好的含育苗土壤的培养盒中，待黑麦草种子发芽后，取茎长3 cm左右的幼苗，均匀移入含有不同铜绿微囊藻浓度的浮床上，水培培养。

本实验设定5个处理组（其中包括一个不接种蓝藻的空白对照组），每组设3个平行。所用培养介质均为新鲜的BG11培养液，初始磷浓度为40 mg/L（以K2HPO4计）。接种组一次性接入如上所述的新鲜藻样，接种量分别为每L培养基质添加0 mL、10 mL、30 mL、50 mL和70 mL的藻样。利用血細胞计数法测定，五个处理组所含M. aeruginosa的初始生物量分别为0 g/L、0.121 g/L、0.164 g/L、0.248 g/L和0.278 g/L。

2.2黑麦草生长情况的观察

本次实验周期为浮床接种后的三周。每隔一周，取生长在不同处理组中的黑麦草，对其根长、鲜重这样的外观形态指标进行观察和记录。所用工具为剪刀，直尺，所用仪器为分析天平（FA1004N）。

2.3黑麦草叶片蛋白含量与丙二醛含量的测定

本次试验中，黑麦草叶片所含蛋白质含量的测定用小牛血清蛋白法（BCA）。样本的前处理步骤如下：收集不同生长时间（一周，两周，三周）的不同处理组的黑麦草各 10 株，研磨称重，然后按照各自不同的重量（g）∶体积（mL）=1∶9 的比例，在离心管中加入 9 倍体积的生理盐水，-20 ℃冰箱冻融3～4次破细胞壁后，按照 3500 转/min，在高速冷冻离心机中离心10 min，取上清液。再用生理盐水按1∶9 稀释成 1% 组织匀浆备用。后续测定和计算方法按照市售的试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国南京）说明书进行。

丙二醛（MDA）含量的测定也包括样本前处理和测试两个阶段，前处理的流程如下：收集不同处理组及不同生长阶段的黑麦草，称重，研磨，然后按照各自不同的重量（g）∶体积（mL）=1∶9 的比例，加入9倍体积的应用提取液（试剂盒自带），放在冰箱内冻融3～4次，以4000 r/min在离心机中离心10 min，取上清液待测。具体测定和计算方法也参照了南京建成的丙二醛测定试剂盒说明书（南京建成生物工程研究所，中国南京）。所有测定都在96孔板中进行，所用仪器为多功能酶标仪（Tecan Infinite 200 Pro，瑞士）。endprint

2.4培养基质中总磷和生化需氧量的测定

在测定黑麦草生理生化数据的同时，收集培养了一周、两周和三周的水培基质，测定其中 TP 和重铬酸钾生化需氧量（CODCr）。总磷的测定采用过硫酸钾消解-钼锑抗比色法，CODCr 的测定采用国标方法[8]。

3结果与分析

3.1蓝藻水华聚集对黑麦草生长情况的影响

为了探索不同接种量的蓝藻对黑麦草生长的影响，我们收集了不同生长阶段的黑麦草植株，对其根长和鲜重进行了测量，结果如表1和表2所示。从表1中可以看出，实验周期内黑麦草在不同处理组均不停生长。与空白对照相比，培养基质中有水华蓝藻的处理组中，黑麦草的根长被刺激，在初始接种量为10～50 mL范围内，这种刺激作用随蓝藻浓度的增加而变得越发明显，但当接种量达到70 mL时，尽管仍表现为刺激，但与其他接种浓度相比，根长明显变短。黑麦草鲜重的变化趋势与根长类似，需要特别指出的是，在70 mL藻液接种组，这种鲜重的刺激现象已经非常微弱，甚至在第三周时与空白对照组几乎相当（表2）。

*平均值 ± 标准误差，单位：cm

从表2中数据可以得知，在水体中存在微囊藻水华时，黑麦草的生长在外观上表现为刺激现象；但当水华聚集严重时，刺激现象有可能减弱或消失。利用水葫芦净化富营养水体的相关报道也发现：各处理中水葫芦的根长、总长、鲜重与实验开始相比都呈增加的趋势，并且随蓝藻浓度的增加，根长、总长增加的幅度减小[9]，这与该研究结果类似。因此，今后在利用黑麦草净化富营养水体时，为了让黑麦草长势更好，应考虑在春末或夏初进行移植。

*平均值 ± 标准误差，单位：g/10株

3.2蓝藻水华聚集对黑麦草叶片中蛋白含量和丙二醛含量的影响

为了从更深层面了解水华蓝藻对黑麦草生长的影响，对黑麦草叶片的蛋白含量和丙二醛（MDA）含量进行了进一步的分析。在本次实验周期内，与空白相比，黑麦草叶片的蛋白含量在大多数接种了微囊藻的处理组都有所升高，只有50 mL接种量处理组在第三周时，蛋白含量比空白组下降。在70 mL处理组，叶片蛋白含量与空白很接近，在第三周时也低于空白组（图1）。这个结果这与前面所述的生长情况的结果是非常相似的。

此外，有趣的是，空白组和10 mL处理组，在这三周内叶片的蛋白含量都是一直增加的，而在其他处理组，叶片蛋白含量的变化趋势是先增加后减少（图1）。这说明：尽管在外观上，黑麦草在含有水华蓝藻的培养基质中仍然持续生长，但其叶片蛋白的合成已经受到了蓝藻的影响而放慢了。在水华蓝藻浓度较高的处理组甚至低于了空白的合成水平。

另外，对黑麦草叶片中MDA含量的分析更是证明了上述论断。如图2所示，与空白组相比，在所有的接种了微囊藻的处理组，叶片中MDA的含量都大大提升了，且随着蓝藻初始接种量的增加，MDA含量也不断增加。在植物的抗氧化防御系统中，MDA含量反映的是植物遇到外界不利影响（如干旱、寒冷、紫外线、水涝、外源污染物等）时的脂质过氧化水平，它的含量越高，说明受到的氧化损伤也越强[10～12]。本次实验结果表明，微囊藻的存在确实使得黑麦草受到一定程度的氧化损伤，且这种损伤存在浓度相关性。

3.3不同处理组培养液中的总磷浓度和重铬酸钾需氧量

最后，对各处理组培养基质中的总磷（TP）浓度和重铬酸钾需氧量（CODCr）进行了测定。结果发现：虽然培养基质中初始磷浓度较高，达到40 mg/L，但生物对磷的利用能力很强。在空白对照组，由于培養液中没有蓝藻，水中磷浓度的降低主要由于黑麦草吸收磷的作用，计算发现它对磷的吸收率超过99%。而在接种蓝藻的处理组，首先，水体中TP浓度随时间的变化规律比较统一，都是逐渐减少（图3）。这说明无论是蓝藻还是黑麦草，随着生物量的增加，对水中磷的吸收都不断增加。其次，若对所有接种组进行比较则发现：培养基质中TP的变化与接种量之间没有一定的规律可寻，但与黑麦草生长情况有一定的关联。如初始接种量在30mL和50 mL时，黑麦草生长较好，水中TP浓度也较高；而在70 mL时，黑麦草生长最差，水中TP浓度也最少。通过计算还发现，10～50 mL接种量时，基质中TP的减少率在78.3%～92.3% 之间；但初始接种量为70 mL时，基质中TP的减少率在90.6%～97.6% 之间（图3）。一方面，蓝藻的新陈代谢过程中，一直存在着新生细胞吸取磷元素，死亡细胞释放磷元素的过程。另一方面，黑麦草与蓝藻之间的相互作用，也会影响黑麦草根部对磷的吸收和释放。因此，其深层原因较为复杂，值得进一步深入研究。

对于培养基质中CODCr的变化规律，从图4中可以看出：初始接种量越多的组，水体的生化需氧量也越大。空白组和10～50mL接种组随着时间的变化，CODCr不断减少或者先增加后降低，而70 mL接种组在第三周时CODCr达到最大值。众所周知，富营养化水体的一个较大的危害就是水中溶解氧的下降，而造成这种现象的原因正是藻类的大量繁殖，本次实验结果也证明了藻类有大量消耗溶解氧的潜能。

然而，蓝藻的世代周期较短。在第二周时，蓝藻死亡分解耗氧量也最大，因藻类的聚集CODCr达到最高值。第三周时分解基本完成，CODCr回落。另外，黑麦草的存在，也加速了藻细胞的分解。需要特别指出的是：70 mL接种处理组在第三周时水中CODCr达到最高峰，可能因为藻类聚集太多，使得分解过程变长。此外，如前所述，第三周时黑麦草在该处理组的长势也较差，可能是由于此时水华聚集过于严重，导致了黑麦草根部缺氧，从而生物量远不如其他处理组。

4结论和展望

本次实验可以得到如下结论：①在3周的实验周期内，当蓝藻初始接种量为10～50 mL时，黑麦草的生长受到刺激，叶片蛋白含量在大多数情况下也高于空白组。而在70 mL接种处理组，黑麦草的生长和叶片蛋白含量都被轻微的抑制；②在所有的接种了微囊藻的处理组，叶片中MDA的含量都大大提升了，且随着初始接种量的增加，MDA含量也不断增加，说明黑麦草受到蓝藻诱发的氧化损伤；③黑麦草能够大量吸收培养基质中的磷，但在水华蓝藻存在时，由于存在竞争和死亡藻体的释放，培养液中TP浓度有所增加，且与接种浓度没有相关性；④初始接种量越多的组，水体的CODCr也越大。若水华聚集过于严重，如初始接种量达到70 mL时，有可能导致黑麦草根部缺氧，严重影响黑麦草的正常生长。endprint

在利用黑麦草净化富营养化水体时，为了黑麦草正常生长并发挥净水功能，应当在水华爆发前就接种进行培养，严重的水华聚集会抑制其功能的发挥。此外，黑麦草与蓝藻共存时对水中营养盐如TP的利用情况比较复杂，值得深入去探索。在此基础上，对浮床植物的进一步筛选和实验研究也需要投入更多的精力。

参考文献：

[1]

Hu WP， Jrgensen SE， Zhang FB. A vertical-compressed three-dimensional ecological model in Lake Taihu， China[J]. Ecological Modelling， 2006， 190（3～4）：367～398.

[2]田锋， 伊连庆. 含磷废水处理的研究现状[J]. 工业安全与环保， 2005， 31（7）：6～8.

[3]吴锋， 战金艳， 邓祥征，等. 中国湖泊富营养化影响因素研究——基于中国22个湖泊实证分析[J]. 生态环境学报， 2012， 21（1）：94～100.

[4]Nyabayo CJ， Mwamburi L， Masai RJ. The effects of native plant species vegetated in constructed wetland on removal of selected pollutants in water of Bomachoge Sub Countyin Kisii County-Kenya[J]. Journal of Biology Agriculture and Healthcare， 2016， 6（14）：68～73.

[5]张甲耀， 夏盛林， 崔克辉. 潜流型人工湿地污水处理系统中芦苇的生长特性及净化能力[J]. 水处理技术， 1998， 24（6）：363～367.

[6]張斐斐， 黄林海， 吴海洋，等. 人工湿地植物的选择与利用及存在的问题[J]. 江西科学， 2016， 34（1）：32～40.

[7]彭辉， 陈智林， 叶锦韶，等. 黑麦草在修复铜-芘复合污染水体过程中对污染物的富集效应[J]. 环境化学， 2012， 31（1）：57～63.

[8]国家环境保护总局. 水和废水检测分析方法（第四版）[M]. 北京： 中国环境科学出版社， 2002.

[9]吴婷婷， 刘国锋， 韩士群，等. 蓝藻水华聚集对水葫芦生理生态的影响[J]. 环境科学， 2015， 36（1）：114～120.

[10]黄志斐， 张喆， 马胜伟，等. BDE209 胁迫对翡翠贻贝（Perna viridis）SOD、MDA 和GSH 的影响[J]. 农业环境科学学报， 2012， 31（6）：1053～1059.

[11]李亮亮， 吴正超， 陈彬，等. 生物炭对化感物质胁迫下番茄幼苗生物量及保护酶活性的影响[J]. 江苏农业科学， 2017， 45（16）：99～103.

[12]Li CS， Wei LP， Sun JM，. Physiological responses of wild diploid banana（Musa acuminate， AA group）to chilling injury[J]. Journal of Southern Agriculture， 2017， 48（8）：1367～1373.endprint