响应面优化超声提取狗枣猕猴桃叶粗多糖研究

陆娟，常清泉，谭莉，白晓仙，王海莲

（长春师范大学化学学院，吉林长春130032）

响应面优化超声提取狗枣猕猴桃叶粗多糖研究

陆娟，常清泉，谭莉，白晓仙，王海莲

（长春师范大学化学学院，吉林长春130032）

以狗枣猕猴桃叶粗多糖得率为响应值，在单因素试验的基础上，采用三因素三水平响应面分析法（RSM），研究超声辅助提取各因素对狗枣猕猴桃叶粗多糖得率的影响，优化超声辅助提取狗枣猕猴桃叶粗多糖最优工艺；利用DPPH自由基清除试验，测定狗枣猕猴桃叶多糖的抗氧化活性。结果表明：超声辅助提取狗枣猕猴桃叶粗多糖最优工艺为超声功率989.61 W，提取时间20.00 min，液固比为80∶1（mL/g），狗枣猕猴桃叶粗多糖得率理论值为5.59%，设定超声功率990 W，提取时间20.00 min，液固比80∶1（mL/g）进行验证试验，狗枣猕猴桃叶粗多糖得率为5.41%。在此条件下得到的狗枣猕猴桃叶多糖具有清除DPPH自由基的能力，清除能力与浓度大小相关。

狗枣猕猴桃；多糖；超声辅助提取；响应面法

狗枣猕猴桃[Actinidia kolomikta（Rupr.et Maxim.）Planch]，是猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属多年生藤本植物，深山木天蓼，俗称狗枣子[1]。狗枣猕猴桃主要分布于我国东北、华北、华中、西北、西南等地，朝鲜、日本、俄罗斯等国家部分地区也有分布，其中吉林省长白山地区资源较为丰富[1]。据文献报道，狗枣猕猴桃叶中含黄酮、有机酸、多糖、挥发油类等化合物[2]，常晓丽、金永日、陆娟等对狗枣猕猴桃叶乙醇提取物中的进行了研究[3-6]，分离得到多个黄酮类化合物和萜类化合物。

众多的研究结果表明，多糖有调节免疫、抗病毒及抗癌、降血糖、刺激造血、抗病毒、美容等作用，并且对机体的毒副作用小[7]。狗枣猕猴桃叶的多糖是其重要的药效物质，具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等作用，颇具研究开发价值[8]。

近期，陆娟等利用响应面法优化了85%乙醇提取后的狗枣猕猴桃叶多糖微波提取工艺[9]，本文继续以85%乙醇提取后的狗枣猕猴桃叶为原料，利用响应面法优化狗枣猕猴桃叶多糖超声辅助提取工艺，利用DPPH自由基清除试验研究狗枣猕猴桃叶多糖的抗氧化活性，为从狗枣猕猴桃叶中获得食品用天然抗氧化剂的工业化生产提供理论参考，也为狗枣猕猴桃叶的充分利用提供了一种有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

狗枣猕猴桃叶：吉林省靖宇县；无水乙醇、95%乙醇、葡萄糖、浓硫酸、苯酚均为分析纯；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸：上海试剂二厂；试验用蒸馏水、超纯水为有机化学实验室自制。

1.2 仪器与设备

TU-1901型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；SL-2010N超声波信号发生器：南京顺流仪器有限公司；Heraeus Multifuge X1R型高速离心机：ThermoFisher SCIENTIFIC。

1.3 方法

1.3.1 狗枣猕猴桃叶粗多糖的提取及样品溶液的制备

准确称取经85%乙醇提取后，干燥的狗枣猕猴桃叶粉末2.0 g，置于超声提取器中，加入已设定的蒸馏水，浸泡12 h后，按照设定的超声功率、提取一定时间，提取液离心，浓缩上层清液至一定体积，加3倍无水乙醇室温下醇沉24 h、离心、得沉淀、脱水、干燥得粗多糖。

分别取10.0 mg粗多糖粉末，精密称定后置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度线，配成样品溶液，备用。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线按照参考文献[9]，以苯酚-硫酸法，测定葡萄糖浓度与吸光度之间的关系，绘制葡萄糖标准曲线，回归方程为A=56.447C-0.047 3，C是葡萄糖浓度（mg/mL），A为吸光度，相关系数R2=0.999 3，线性范围：0.001 0 mg/mL~0.012 0 mg/mL。

1.3.3 单因素试验

在其他条件相同的情况下，分别研究超声功率450、600、750、900、1 050、1 300 W、超声时间 5、10、20、30、40、50 min、液固比 40∶1、60∶1、80∶1、100∶1、120∶1、140∶1（mL/g）3个因素对多糖提取得率的影响。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验基础上，采用三因素三水平Box-Benhnken Design（BBD）试验设计方案，以超声提取功率（A）、超声时间（B）、液固比（C）为考察变量，以狗枣猕猴桃叶粗多糖提取率（Y）为响应值，应用Design-Expert8.0.5软件，建立数学回归模型，确定狗枣猕猴桃叶粗多糖的最佳超声波提取工艺。试验因素和水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 DPPH自由基清除试验

按照参考文献[10-11]方法，分别往2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中加入不同浓度的多糖溶液2 mL，在暗处反应30 min后，在517 nm处测量其吸光度，按照公式 E=（ADPPH-As）/ADPPH计算清除率，其中：ADPPH为DPPH溶液吸光度值，As为样品DPPH溶液吸光度。同时，用相应的VC溶液代替多糖溶液，测定VC的清除能力。

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析

2.1.1 超声功率对多糖提取率的影响

超声功率对多糖提取率的影响见图1。

图1 超声功率对粗多糖提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of crude polysaccharide

由图1可知，随着超声功率的增大，多糖提取率逐渐增大，但当超声功率为900 W时，多糖提取率可达最大值，其后随着功率的增大，多糖提取率反而逐渐降低。这可能是由于超声通过空化效应，破坏植物细胞壁，使组织细胞内部的多糖成分与溶剂充分接触而快速溶解转移[11]，超声功率增大，较多的多糖可以渗透细胞膜进入细胞和溶剂，然而，过高的功率会可能会致使多糖解聚、聚合和黏度降低，这将导致提取得率减少[12]，因此选择最佳超声功率为900 W。

2.1.2 超声时间对多糖提取率的影响

超声时间对多糖提取率的影响见图2。

图2 超声时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield rate of polysaccharide

由图2可知，随着超声时间的延长，多糖提取率呈现增大的趋势，当超声时间为20 min时，多糖提取率达到最大，其后随着提取时间的增大，多糖提取率有所下降。这可能是因为超声时间过长，可能会诱导部分多糖的降解[13]，因此，最佳提取时间是20 min。

2.1.3 液固比对多糖提取率的影响

液固比对多糖提取率的影响见图3。

图3 液固比对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield rate of polysaccharide

由图3可知，随着液固比的增大，多糖提取率逐渐增大，当液固比为80∶1（mL/g）时，多糖提取率达到最大，其后随着液固比的增大，多糖提取率反而逐渐降低。因此最佳液固比为80∶1（mL/g）。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果

响应面试验设计结果见表2。

表2 响应面试验设计及响应结果Table 2 RSM design and response result values

通过Design-Expert8.0.5软件对表2中的响应面试验结果进行回归分析，以狗枣猕猴桃叶粗多糖的提取率（Y）为因变量，超声功率（A）、超声时间（B）以及液固比（C）为自变量，进行回归分析，得到二次多项回归模拟方程：Y（%）=6.70-0.48A+0.73B+0.98C-0.75AB-1.04AC+0.40BC-2.30A2-2.60B2-2.13C2。对上述回归模型进行F检验，判定回归方程中各变量对响应值影响的显著性，概率越小，则相应变量的显著程度越高，方差分析结果见表3。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由方差分析表3可以看出，模型F=158.53，p＜0.000 1差异有统计学意义，说明建立的模型极显著（p＜0.01）；失拟项 F=0.21，P=0.475 5，失拟项相对于绝对误差不显著，说明模型的拟合程度良好，未知因素对试验结果干扰很小。模型R2=0.9203，Adj R2=0.8889，表明模型与实际试验拟合较好，试验误差较小，可以用此模型对狗枣猕猴桃叶粗多糖的超声辅助提取进行分析和预测。对回归方程系数进行显著性检验，表明超声功率、超声时间、液固比、3个因素之间的交互作用及三因素的二次项均对（A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2）对狗枣猕猴桃叶粗多糖的提取率影响均显著（p＜0.05）。

2.2.2 双因子交互作用分析

回归方程所绘制的三维（3D）响应面和二维（2D）等高线生成的模型图见图4～图6。

图4 超声功率和提取时间对多糖提取得率影响的响应曲面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots showing effect of ultrasonic power and extraction time

由图4为超声功率（A）和超声时间（B）对多糖提取率的影响，由图可知，从750 W到900 W范围内，超声功率（A）增加多糖提取得率也相应增加，但当超声波功率超过900 W，提取率反而下降。从时间角度得出，10 min到25 min范围内，逐渐增加超声时间，多糖提取得率也会相应增加，但超过25 min后多糖得率下降。

超声功率（A）和液固比（C）交互作用对多糖提取得率的影响见图5。

图5 超声功率和液固比对多糖提取得率影响的响应曲面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing effect of ultrasonic power and liquid-solid ratio

由图5可以得出，液固比从60∶1（mL/g）增加到90∶1（mL/g）时，多糖提取得率增加，液固比超过90∶1（mL/g）时，多糖提取率下降。超声功率（A）从750增加到900 W时，多糖提取得率也相应增加，但当超声功率超过900 W，提取率反而下降。

液固比（C）和超声波提取时间（B）交互作用对多糖提取得率的影响见图6。

图6 液固比和提取时间对提取得率的影响Fig.6 Response surface and contour plots showing effect of extraction time and liquid-solid ratio

由图6可以得出，液固比在60∶1（mL/g）～90∶1（mL/g）范围内，多糖提取得率随着液固比的增大而增加，液固比超过90∶1（mL/g）后，多糖提取率下降。在10 min~20 min范围内，逐渐增加超声时间，多糖提取得率缓慢增加，而超过20 min，随着提取时间延长，粗多糖提取率有所下降。

2.2.3 粗多糖对DPPH自由基清除能力

狗枣猕猴桃叶粗多糖对DPPH自由基的清除能力见图7。

图7 多糖对DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH radical scavenging rate of polysaccharides

由图7可知，狗枣猕猴桃叶多糖对DPPH自由基具有清除作用，且清除能力随着浓度的增大而增大，但小于VC对DPPH自由基的清除作用。经计算表明，多糖清除DPPH自由基的半数抑制浓度（IC50）为0.43 mg/mL。以上结果表明，狗枣猕猴桃叶粗多糖可以作为一种天然的抗氧化剂。

3 结论

狗枣猕猴桃叶粗多糖的最优超声波辅助提取工艺为：超声功率989.61 W，提取时间20.00 min，液固比为80∶1（mL/g）。在此条件下，狗枣猕猴桃叶多糖提取得率理论值为5.59%。修正上述实验条件为超声功率为 990 W，提取时间 20.00 min，液固比为 1∶80（mL/g），进行超声辅助提取多糖，平行测定3次，所得狗枣猕猴桃叶多糖提取率为5.41%，与理论值相差不大。结果表明超声辅助提取可以显著提高狗枣猕猴桃叶粗多糖的提取率，具有提取时间短，有效成分的提取率高成本低、低温保护热敏性成分、污染小等优点。此外，超声辅助提取得到的狗枣猕猴桃叶多糖具有清除DPPH自由基的能力，可以作为一种天然的抗氧化剂。

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Optimization of the Ultrasonic-assisted Extraction of Polysaccharide from the Leaves of Actinidia kolomikta Using Response Surface Methodology

LU Juan，CHANG Qing-quan，TAN Li，BAI Xiao-xian，WANG Hai-lian
（College of Chemistry，Changchun Normal University，Changchun 130032，Jilin，China）

The ultrasonic-assisted extraction technology and antioxidant activities of polysaccharide from the leaves ofActinidia kolomikta（Rupr.et Maxim.）Planch were researched in this paper.Taking the yield of crude polysaccharide as the response value，on the basis of single factor experiment，the effect of ultrasonic-assisted extraction factors on polysaccharide were researched.A three-level-three-factor response surface methodology design was employed to optimize the three extraction variables and to determine the optimum technology.And the antioxidant capacity of the polysaccharide was assessed through DPPH radical scavenging test.The experimental results showed that the optimum technology was that the ultrasonic power was 989.61 W，the extraction time was 20 min，the extraction liquid-to-solid ratio was 80 ∶1（mL/g），under the condition the yield of the crude polysaccharide from the leaves ofActinidia kolomiktawas 5.59%.Setting ultrasonic power as 990 W，extraction time as 20 min and liquid-to-solid ratio as 80 ∶1（mL/g）to verify the optimum extraction technology，and the yield of the crude polysaccharide was 5.41%.The polysaccharide extracted from the leaves ofActinidia kolomiktahad effect of scavenging DPPH radical，and the ability of scavenging DPPH radical was proportional to the concentration of polysaccharide.

Actinidia kolomikta；polysaccharide；ultrasonic-assisted extraction；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.014

陆娟（1982—），女（汉），副教授，理学博士，研究方向：生物有机物提纯及活性研究。

2017-04-06