响应面法对核桃粕中蛋白质提取工艺的优化

安传相，毕远林，裴璞花，马立志，2，*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州贵阳550005）

响应面法对核桃粕中蛋白质提取工艺的优化

安传相1，毕远林1，裴璞花1，马立志1，2，*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州贵阳550005）

核桃蛋白是一种营养平衡的蛋白质，其营养价值与动物蛋白相近。采用微波辅助NaOH提取核桃粕中的蛋白质，研究液料比、NaOH浓度、温度、时间各单因素对核桃蛋白提取率影响。在单因素筛选的条件下，利用响应面优化核桃粕中蛋白质的提取工艺，确定较佳的提取工艺条件：液料比40∶1（mL/g）、NaOH浓度0.08%、提取温度58℃、时间110 min，核桃蛋白提取率高达56.51%。

响应面；核桃；超声波；蛋白质

核桃（Juglans regiaL.）又名胡桃、羌桃，系胡桃科核桃属植物[1]。它与扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果[2]。核桃中核桃仁的油脂含量高达65%左右，其中大部分为不饱和脂肪酸，主要由软脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸组成，另外核桃仁中还含有约15%的蛋白质[3]。蛋白质是构成生命的物质基础。其作为生命活动的主要承担者，担负着新陈代谢、免疫保护和酶的催化等多种生理功能，并在生物体的生命活动和几乎所有的生物过程中起着至关重要的作用[4]。蛋白质的营养价值取决于其中氨基酸的种类和含量。核桃蛋白作为一种优质植物蛋白，含有18种氨基酸，其中含有8种人体所必需的氨基酸，8种必需氨基酸的含量比例合理，接近联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）规定的标准氨基酸配比[5]。近年来已有相关文献报道了核桃粕中蛋白质的提取工艺[6-7]，但提取率相对较低，不能有效的利用核桃粕中的蛋白质，造成宝贵资源的浪费。因此本研究以核桃粕为原料，应用超声波对蛋白质进行辅助提取，为开发核桃蛋白产品，对实现核桃粕的综合利用、提高副产物的附加值以及延长核桃产业链具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

1.1.1.1 原材料

核桃（黔产5号）：贵州省毕节市赫章县产。

1.1.1.2 化学试剂

考马斯亮兰G-250：天津市登科化学试剂有限公司；牛血清蛋白：北京中生瑞泰科技有限公司；氢氧化钠：成都金山化学试剂有限公司；硫酸铜：宜兴市化学试剂厂；硫酸钾：天津市天力化学试剂有限公司；硼酸：天津市优谱化学试剂有限公司；甲基红、亚甲基蓝：天津市科密欧化学试剂有限公司；浓硫酸：北京化工厂；85%磷酸：重庆川东化工（集团）有限公司；95%乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器

6YZ-180液压榨油机：河南源通机械设备有限公司；FA2104万分之一电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；DL-5-B飞鸽牌系列离心机：上海安亭科学仪器厂；WBZ-PPLC智能静态微波真空干燥机：南京杰全微波设备有限公司；PHB-4雷磁牌数字型PH计：上海精科雷磁公司；KQ-500DE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DK-S26电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；UV-2550紫外可见分光光度计：岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质的含量测定

采用凯氏定氮法（GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》）。

1.2.2 蛋白质含量标准曲线的绘制

1）考马斯亮兰G-250试剂的制备[8-9]。

2）标准蛋白质溶液（0.1 mg/mL）：称取 10 mg牛血清蛋白（Albumin from bovine serum，BSA），用蒸馏水定容至100 mL。

3）标准曲线的回归方程的建立[10]。

1.2.3 核桃蛋白提取率的测定

蛋白质的提取率以浸出率为指标，蛋白质浸出率按照以下公式计算。

式中：X 为浸出率，%；M1为核桃粕质量，g；M2为浸出的蛋白质质量，g。

1.2.4 单因素对核桃蛋白提取的影响

分别以不同的提取方式、液料比、NaOH浓度、提取温度及时间为单因素，考察各因素对核桃蛋白提取率的影响。

1.2.4.1 浸提方式对核桃蛋白提取率的影响

称取约2.0 g脱脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），温度40℃，0.08%NaOH溶液，分别采用常温、水浴、磁力搅拌器和超声波的方法分别对脱脂核桃粕浸提70 min，4 000 r/min离心20 min，去油层及沉淀并过滤，取0.5 mL滤液定容100 mL。以蛋白质浸出率为指标，确定较佳的提取方式。

1.2.4.2 料液比对核桃蛋白提取率的影响

称取约2.0 g脱脂核桃粕，在温度40℃，0.08%NaOH 溶液，分别按液料比为 20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1（mL/g）的条件下对核桃粉超声波浸提70 min，4 000 r/min离心20 min，确定料液比对提取核桃蛋白率的影响。

1.2.4.3 NaOH浓度对核桃蛋白提取率的影响

称取约2.0 g脱脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），温度40℃，分别用0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%NaOH溶液超声波方法浸提70 min，4 000 r/min离心20 min，并测定蛋白质的含量以蛋白质浸出率为指标，确定NaOH溶液浓度对提取核桃蛋白率的影响。

1.2.4.4 温度对核桃蛋白提取率的影响

称取约2.0 g脱脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），NaOH 溶液浓度 0.08%、温度分别为 30、40、50、60、70、80℃条件下用超声波方法浸提70 min，4 000 r/min离心20 min，确定浸提温度对提取核桃蛋白率的影响。

1.2.4.5 时间对核桃蛋白提取率的影响

称取约2.0 g脱脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），温度40℃，0.08%NaOH溶液，采用超声波辅助的方法分别对脱脂核桃粕浸提30、50、70、90、110、130 min，4 000 r/min离心20 min，以蛋白质浸出率为指标，确定浸提时间对提取核桃蛋白率的影响。

1.2.5 响应面法优化核桃蛋白的提取

在单因素试验的基础上，运用Design-Expert8.0软件程序根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用四因素三水平，以核桃蛋白的提取率为响应值，对核桃蛋白提取条件进行优化。因素水平编码表见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 Factors and levels coding table

1.2.6 验证性试验

在响应面优化条件下，进行验证性试验，与理论预测值进行比较，以验证优化结果。

2 结果与分析

2.1 蛋白质的含量测定

蛋白质的含量测定结果见表2。

表2 蛋白质含量Table 2 The content of protein

2.2 标准曲线回归方程的建立

蛋白质含量标准曲线如图1所示，线性关系良好。此标准曲线的回归方程y=5.512 6x+0.013 1，R2=0.996 7，说明牛血清蛋白（Albumin from bovine serum）在0~0.1 mg/mL范围内所呈现的线性关系良好。

图1 蛋白质标准曲线Fig.1 Standard curve of protein

2.3 单因素试验

2.3.1 不同的辅助方式对核桃蛋白提取率的影响

不同的辅助方式对核桃蛋白提取率的影响见表3。

表3 不同的辅助方式对核桃蛋白提取率的影响Table 3 Effect of different assistant methods on the extraction rate of walnut protein

由表3可知，采用超声波进行辅助提取时，核桃蛋白的提取率最高，可以达到33.51%，其他辅助提取方式都较小。故选取超声波作为核桃蛋白的辅助提取方式，在以下试验中，均以超声波为核桃蛋白的辅助提取方式。

2.3.2 液料比对核桃蛋白提取率的影响

液料比对核桃蛋白提取率的影响见图2。

图2 液料比对提取率的影响Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on extraction rate

从图2可知，在一定的范围内，液料比越大，越利于蛋白质的溶解。当达到一定程度时，蛋白质的溶出率达到动态平衡。若提取液的体积大，增加后续离心工作量。当液料比达到40∶1（mL/g）时核桃蛋白的提取率不再明显提高，综合考虑，选择料液比30∶1、40∶1、50 ∶1（mL/g）3 个水平。

2.3.3 NaOH浓度对核桃蛋白提取率的影响

改变NaOH的浓度，核桃蛋白提取率变化如图3所示。

图3 NaOH浓度对提取率的影响Fig.3 Effect of NaOH concentration on extraction rate

当浓度高于0.08%时，核桃蛋白的提取率反而下降。是由于碱性太强会使蛋白质变性，而且还会产生异味，因此NaOH的浓度在0.08%左右比较合适。

2.3.4 温度对核桃蛋白提取率的影响

温度对核桃蛋白提取率的影响见图4。

图4 温度对提取率的影响Fig.4 Effect of temperature on extraction rate

从图4可以看出，在一定范围内，随着温度的升高提取率升高，当温度超过60℃时，提取率开始下降，是由于核桃蛋白的变性温度为67℃左右[11]，超过这个温度提取率会大大降低，因而核桃蛋白最佳提取温度应控制在60℃左右。

2.3.5 时间对核桃蛋白提取率的影响

时间对核桃蛋白提取率的影响见图5。

图5 时间对提取率的影响Fig.5 Effect of time on extraction rate

从图5可以看出，提取时间越长，核桃蛋白的提取率越高，当提取时间超过110 min后提取率则不再明显提高。为了提高工作效率，核桃蛋白的提取时间应控制在110 min内。

2.3.6 响应面模型的建立

Box-Behnken响应面试验设计结果见表4。Box-Behnken响应面试验方差分析见表5。

表4 Box-Behnken响应面试验设计结果Table 4 The results of Box-Behnken response surface design

续表4 Box-Behnken响应面试验设计结果Continue table 4 The results of Box-Behnken response surface design

表5 Box-Behnken响应面试验方差分析Table 5 Analysis of variance of Box-Behnken response surface design

利用Design-Expert8.0进行二次多元回归拟合，可得液料比（A）、浓度（B）、温度（C）以及时间（D）与响应值提取率（Y）的关系。其多元二次回归方程为：Y=56.13+2.15A-0.67B-2.44C-0.85D-0.37AB+1.72AC-0.61AD+1.44BC-0.17BD+0.85CD-7.70A2-2.25B2-9.80C2-11.83D2。

由表5的方差分析结果可知，方程模型的p＜0.000 1＜0.01，表明该方程模型极显著。模型失拟项P=0.147 7＞0.05，表明响应面试验结果和数学模型拟合良好，试验误差小，因此，可以使用该数学模型对试验结果进行分析。一次项中A影响极显著（p＜0.01）、B和C的影响显著、D影响不显著，各因素对核桃蛋白提取率的影响由大到小依次为液料比＞温度＞浓度＞时间。

响应面与等高线图见图6～图10。

图7 Y=f（A，C）的响应面与等高线Fig.7 Response surface and contour of Y=f（A，C）

图8 Y=f（A，D）的响应面与等高线Fig.8 Response surface and contour of Y=f（A，D）

图9 Y=f（B，C）的响应面与等高线Fig.9 Response surface and contour of Y=f（B，C）

图10 Y=f（B，D）的响应面与等高线Fig.10 Response surface and contour of Y=f（B，D）

由图6～10的响应面与等高线分析，所有交互项对蛋白质提取率的影响都不显著。每个影响因子对于核桃蛋白提取率都有一个最佳稳定条件，试验得到的最佳组合为：液料比 41.13∶1（mL/g）、NaOH 浓度0.08%、提取温度58.74℃、时间109.33 min，此时，模型预测的核桃蛋白最大提取率为56.51%。

2.4 验证试验

根据上述优化的试验结果，并为了实际操作方便操作，实际取值液料比 40∶1（mL/g）、NaOH 浓度 0.08%、提取温度58℃、时间110 min，在此工艺条件下进行3次重复验证试验，实际测得蛋白质提取率的平均值为55.46%，比预测值相差1.05%，说明模型能够用于预测核桃粕蛋白质提取工艺参数。

3 结论

在单因素试验的基础上采用四因素三水平的响应面分析法对超声波辅助提取核桃蛋白进行优化。试验确定碱溶酸沉法提取核桃粕中蛋白质的最佳工艺条件为：液料比 40 ∶1（mL/g）、浓度 0.08%、提取温度58℃、时间110 min，此时，核桃蛋白提取率高达56.51%。因此，响应面分析法为优化核桃蛋白提取工艺提供理论依据，为后续对核桃粕中蛋白质的合理开发利用提供参考意见。

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Optimization of Extraction Technology of Protein from Walnut Meal by Response Surface Methodology

AN Chuan-xiang1，BI Yuan-lin1，PEI Pu-hua1，MA Li-zhi1，2，*
（1.Wine and Food Engineering College of Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Food and Pharmaceutical Engineering Institute of Guiyang University，Guizhou Engineering Research Center for Fruit Processing，Guiyang 550005，Guizhou，China）

Walnut protein is a balanced protein，it's nutritional value is similar with that of animal protein.Present work employed NaOH assisted by ultrasonic to extract the protein in walnut meal，and the effect of single factor like liquid material ratio，NaOH concentration，temperature and time had been studied.Under the condition of single factor screening，the extraction process of protein in walnut meal was optimized by response surface methodology，the results showed that the optimum extraction conditions of walnut protein were as follows：the liquid-solid ratio 40∶1（mL/g），the concentration of 0.08%，extraction temperature 58℃and extraction time 110 min，the maximum extraction rate of walnut protein was 56.51%.

response surface；walnut；ultrasonic；protein

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.008

贵州省农业公关项目（黔科合支撑[2016]2539号）；贵州省果品加工、贮藏与安全控制协同创新中心（黔教合协同中心字[201306]号）；贵州省教育厅重点学科建设（黔学位合字ZDXK[2014]13号）

安传相（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏。

*通信作者：马立志（1964—），男，教授，硕士，主要从事农产品加工与贮藏方向研究。

2017-03-21