超低温冷冻保存伯氏鼠疟原虫实验方法的改进

陈剑煌，黄棉桃，邱灿华，朱兆玲，李美玉

（中山大学医学实验教学中心，广东 广州 510080）

超低温冷冻保存伯氏鼠疟原虫实验方法的改进

陈剑煌，黄棉桃，邱灿华，朱兆玲，李美玉*

（中山大学医学实验教学中心，广东 广州 510080）

本文采用-196℃的液氮冷藏，用含30%DMSO生理盐水为保护液，冷冻保存鼠疟血症达35%的疟原虫种株，经6年的追踪观察，感染成功率100%，且原虫的生物学特性稳定，是较理想的动物疟原虫的保种方法。

鼠疟原虫；冷冻保存；实验方法

疟原虫保种在疟疾实验研究中占有重要的地位。构建疟原虫动物模型已成为疟疾研究的一项基本技术[1]。开展疟原虫的体外培养及研究，虫种的保存是一个重要环节。常规伯氏疟原虫保种方法是采用小鼠腹腔接种传代法或将感染疟原虫小鼠直接低温冷冻保存的方法[2]。我们在教学和科研中取感染疟原虫小鼠的血液，加入含30%DMSO生理盐水做保护剂，置液氮冷冻保存，从2010～2016年每年复苏1次，追踪观察了6年。结果表明，伯氏鼠疟原虫冷冻保存效果稳定，冷冻保存保持了寄生虫的抗原性和生物学特性，因此可广泛用于科研、教学等领域。现将实验方法介绍如下。

1 实验材料

实验动物：昆明小白鼠由中山大学动物中心提供。

虫株：伯氏疟原虫来自中山大学实验教学中心

冷冻保护液配制：取3 mLDMSO加入到7 mL生理盐水中混匀。

冻存介质：液氮（-196℃）。

2 实验方法

2.1 接种方法

选择体重约25 g的健康昆明小鼠作为保种动物。接种前，先取种鼠尾尖血制作薄涂片，将感染度适中的伯氏疟原虫作为种源鼠。在1 mL消毒生理盐水中加0.01 mL肝素，取种源鼠尾尖血2滴，加入到肝素生理盐水中混合均匀，取0.2 mL经腹腔注入健康小鼠体内。接种后逐日制作血涂片观察原虫密度。

2.2 超低温保存方法

鼠疟血症达35%左右，并以成熟裂殖体期为主时取鼠眼球血2滴，加入保护液10 mL（DMSO 3 mL+生理盐水7 mL），混匀后分装到2 mL的冷冻管中，每支0.5～1 mL，旋紧管盖，贴好标签，置于室温静止30min后，沉入液氮中贮存，先置于液氮罐的颈部（约-70℃），30 min后置液氮中（-196℃）冻存。

2.3 解冻复苏

从液氮取出冷冻管，迅速投入37～40℃温水中，置室温约5分钟即可取保护液感染动物。

2.4 观察指标

接种后根据不同时间感染的虫株观察动物出虫比例及出虫时间。

3 结 果

用上述方法，鼠疟原虫经液氮低温冷冻保存，6年后对健康动物均具有感染的活力。第一代出虫时间随冷冻时间推迟，从转种第二代开始出虫时间与冷冻前一致。说明冷冻对原虫的毒力基本没有影响。见表1。

表1 冷冻保存鼠疟原虫红内期的感染活力

4 讨 论

以前实验室保种疟原虫是将感染疟原虫小鼠整体直接低温冷冻保存的方法，但保存时间不够长，最长可达1年。本实验用3份DMSO和7份生理盐水混合做保护液，加入鼠疟血症达35%时的鼠眼球血2滴，分别于冷冻后的1年、2年、3年、4年、5年、6年后解冻培养，追踪观察了6年。结果显示：冻存1～3年后第一代出虫时间第六天开始；冻存4～5年后第一代出虫时间第7天开始；冻存6年后第一代出虫时间第8天开始。当第一代鼠疟血症达35%时，取种源鼠尾尖血2滴，加入到1 mL肝素生理盐水中混合均匀，取0.2 mL经腹腔注入健康小鼠体内，做为第二代疟原虫种鼠，经过二、三代的培养，疟原虫很快恢复生长发育，原虫密度逐渐升高与种鼠保持一致。上述结果表明，低温冷冻伯氏疟原虫是一种简便可行的方法，保存要求的条件也比较简单，通过实验观察，保存期限可长达6年。本法优点是比起超低温疟原虫动物整体保存法保存的虫种时间长，所占空间小，而且本方法简便、易于操作，成功率高，用液氮低温冷冻保存，疟原虫的生物学特性基本没有改变，保持了原虫在红细胞内生长发育的原有的环境条件，血液的各种成分起到了保护剂的作用[3-4]。冻存原虫的活力至第二次转种后活力增强，逐渐接近对照组。本实验方法省时省力，是较理想的动物疟原虫的保种方法。

[1] 彭绍兰,周 升.疟原虫感染免疫机制研究进展[J].国际医学寄生虫病杂志,2010,37(6):338-339.

[2] 王君芗,等.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1991,9(2):133.

[3] 夏志贵,杨曼妮,周水森.2011年全国疟疾疫情分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2012,30(6):419-422.

[4] 金立群,骆建民,傅玉才,等.约氏疟原虫与伯氏疟原虫侵入期抗原的初步研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2003,21(5):272-274.

Improvement of experimental method for cryopreservation of Plasmodium berghei

CHEN Jian-huang1, HUANG Jin-tao1, QIU Can-hua1, ZHU Zhao-ling1, LI Mei-yu＊

(Medical experiment teaching center of Zhongshan University, Guangdong Guangzhou 510080,China)

This paper uses liquid nitrogen of -196, refrigerated,with 30%DMSO saline as protective solution,cryopreservation of mouse malaria in 35% strains of Plasmodium species,observed after 6 years of followup,with a success rate of 100%,stable biological characteristics and protozoa,is an ideal method for preservation of animal plasmodium.

Rat Plasmodium; Cryopreservation; Experimental method

R382

B

ISSN.2095-8242.2017.055.10705.02

中山大学教改基金项目（50000-16320016）、中华医学会医学教育分会和中国高等教育学会医学教育专业委员会医学教育研究立项课题（2016B-SY027）

李美玉，女，E-mai:limeiyu@mail.susy.edu.cn

本文编辑：吴玲丽