7个变异红叶杜仲叶片色素及活性成分分析

杜庆鑫 庆 军 朱景乐 杜红岩 杜兰英*

(1.中国林业科学研究院经济林研究开发中心，郑州 450003； 2.国家林业局杜仲工程技术研究中心，郑州 450003)

7个变异红叶杜仲叶片色素及活性成分分析

杜庆鑫1,2庆 军1,2朱景乐1,2杜红岩1,2杜兰英1,2*

(1.中国林业科学研究院经济林研究开发中心，郑州 450003；2.国家林业局杜仲工程技术研究中心，郑州 450003)

为探讨不同变异类型红叶杜仲叶片呈色机理及活性成分含量，以7个不同变异红叶杜仲和绿叶杜仲为材料，对叶片颜色、色素分布、含量及活性成分含量进行测定分析。结果表明：7个变异红叶杜仲叶片正面呈暗红或紫红色，栅栏组织呈红色或暗红色；背面颜色3、5和6号呈红色，下表皮也呈红色，1、2、4和7号为绿色，下表皮透明；7个变异红叶杜仲叶片Ca、Cb和CT含量均低于对照杜仲叶片，而CCar、CF含量以及CCar/CT、CF/CT值均显著高于对照叶片，叶片色素含量在7个红叶杜仲间也存在一定差异；7个变异红叶杜仲叶片5种活性成分含量均较高，且绿原酸、京尼平苷和总黄酮含量明显高于对照杜仲叶片。叶片中CF分布、含量及CF/CT值是红叶杜仲呈色差异的主要原因，高活性成分含量使其在药用方面有很大的开发利用潜力。本研究可为观赏兼药用杜仲资源选育提供材料。

红叶杜仲；叶片；色素；活性成分

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)为杜仲科(Eucommiaceae)杜仲属(Eucommia)植物，是我国特有的名贵药材树种，同时可以改善生态环境，增加碳汇，具有很高的经济价值[1～2]。国内外学者对杜仲育种、栽培及综合利用技术进行了长期系统研究，极大地促进了杜仲产业快速发展，特别是杜仲叶片的开发利用日益受到重视，以杜仲叶片为原料在食品、保健品、饲料添加剂及化妆品等领域开发出的系列产品备受市场青睐[3～4]。为了加速我国叶用杜仲良种选育进程，更好地开发利用叶用杜仲资源，中国林业科学研究院经济林研究开发中心选育出“华仲11号”、“华仲12号”及“密叶杜仲”叶用型杜仲良种[5]，西北农林科技大学选育出“秦仲1～4号”叶、皮兼用型杜仲良种[6]。

红叶杜仲是近年来发现的叶片变异型杜仲，其叶片呈红色或紫红色，树形优美，适应性较强，是园林绿化的首选树种之一；另一方面，红叶杜仲叶片中活性成分含量对其药用价值有重要影响。目前有关红叶杜仲叶片结构、色素及活性成分含量的研究较少。本文以7个不同变异红叶杜仲和普通绿叶杜仲为材料，通过对叶片颜色、叶片结构特征观察以及叶片色素含量测定，探讨其呈色差异的原因和机理，同时，对叶片中活性成分含量进行测定，进一步探究其药用价值，以期为红叶杜仲观赏价值、药用价值及新品种选育提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

试验材料：7个不同变异的红叶杜仲和普通绿叶杜仲叶片均采自中国林科院经济林研究开发中心试验基地一年生嫁接苗，低温冷藏带回实验室进行拍照和徒手切片实验；叶片色素和活性成分含量测定的样品采用低温干燥并研磨成粉。普通绿叶杜仲叶片为对照(CK)。

仪器：MICROTEK扫描仪(上海中晶科技有限公司)；低温冷冻干燥机(LABCONCO)；恒温水浴摇床(美国精骐)；OLYMPUS-BX51型光学显微镜(日本奥林巴斯)；JA-3003千分之一天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；Cary 300紫外-可见分光光度计(美国安捷伦)；Shimadzu LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津)；SPD-20A紫外检测器(日本岛津)；AG135型十万分之一电子天平(METILER TOLEDO)；HT-300BQ型数控超声波清洗器(济宁恒通超声电子设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 叶色及叶片结构观察

8份杜仲材料叶片均在成熟期采集，利用MICROTEK扫描仪对叶片正面、背面扫描并拍照，观察叶色差异。叶片结构观察采用改进徒手切片法[7]，双刀片紧压并排切取叶片中部带叶脉的部分，用湿毛笔轻轻从刀口取下，放入盛水培养皿中，挑选好的切片转移至滴水的载玻片上，用显微镜观察并拍照。

1.2.2 叶片色素含量测定

采用直接浸取法[8]提取叶绿素和类胡萝卜素含量，称量干燥叶片粉末0.100 g，加入80%丙酮10 mL，置于黑暗处浸取72 h，然后取上清液，分别测定445、644、662 nm处的吸光度值。采用直接法吸收光谱[9]测定花色苷含量，称量干燥叶片粉末0.100 g，加入1% HCl甲醇溶液10 mL，置于32℃恒温水浴摇床5 h，过滤，以1% HCl甲醇溶液定容到10 mL，分别测定530、657 nm处吸光度值。每份材料重复3次，叶片色素含量计算方法如下：

叶绿素a(Ca)=(9.78×A662-0.99×A644)V/(W1000)；

叶绿素b(Cb)=(21.4×A644-4.65×A662)V/(W1000)；

总叶绿素(CT)=Ca+Cb；

类胡萝卜素(CCar)=(4.69×A445)V/(W1000)-0.268×(Ca+Cb)；

花色苷(CF)=(A530-0.25×A657)V/(W1000)。

式中：A为吸光度值，C为色素浓度(mg·g-1)，V为提取液体积(mL)，W为样品干质量(g)。

1.2.3 叶片活性成分含量测定

采用AlCl3显色法[10]测定叶片中总黄酮含量，采用HPLC法[11]测定叶片中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的含量。

1.3 数据处理

采用Excel对结果进行初步分析，采用SPSS进行ANOVA分析和Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 叶片颜色及结构差异

7个红叶和对照杜仲叶片正面及背面颜色见图1。1、2和4号杜仲叶片正面呈暗红色，背面为绿色；7号杜仲叶片正面呈紫红色，背面为绿色；3、5和6号杜仲叶片正面和背面均呈紫红色， 5号杜仲叶脉也呈红色。对照杜仲叶片正面和背面均为绿色。7个红叶和对照杜仲叶片徒手切片观测结果见图2。8个杜仲叶片海绵组织均为绿色。1、2和4号杜仲叶片栅栏组织呈暗红色，下表皮透明；7号杜仲叶片栅栏组织呈亮红色，下表皮透明；3号杜仲叶片栅栏组织和下表皮呈浅粉色，颜色较淡；5和6号杜仲叶片栅栏组织和下表皮均呈亮红色，颜色较深。对照杜仲叶片栅栏组织为为绿色，上下表皮透明。

图1 杜仲叶片正面和背面颜色Fig.1 The front of blade and back of E.ulmoides leaves

图2 杜仲叶片徒手切片图(10×)Fig.2 Free-hand sections of E.ulmoides leaves(10×)

2.2 叶片光合色素含量差异

供试杜仲叶片色素含量见表1。7个红叶和对照杜仲叶片色素含量均存在极显著差异(P<0.01)。对照杜仲叶片Ca、Cb和CT含量均为最高，且Cb含量显著高于7个红叶杜仲Cb含量，7个红叶杜仲中，5号杜仲叶片Ca、Cb和CT含量均为最低，且显著低于其它6个红叶杜仲叶片。对照杜仲叶片CCar和CF含量最低，且显著低于7个红叶杜仲CCar含量，6号杜仲叶片CCar(0.81 mg·g-1)和CF(0.95 mg·g-1)含量最高，其次是7号(0.66和0.89 mg·g-1)。2、5、6和7号杜仲叶片Car/CT值显著高于其他杜仲叶片；5号杜仲叶片CF/CT值最大，且显著高于其它杜仲叶片，其次是6和7号；8个杜仲叶片中，CF/CT值均比Car/CT值大。

表1 杜仲叶片色素含量

注：**表示P<0.01水平上差异显著，数值后面同列不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note:**means significant difference atP<0.01,different letters in the same column behind value mean significant difference(P<0.05),the same as below.

表2 杜仲叶片活性成分含量

2.3 叶片活性成分含量差异

供试杜仲叶片活性成分含量见表2。7个红叶和对照杜仲叶片活性成分含量均存在极显著差异(P<0.01)。对照杜仲叶片桃叶珊瑚苷(29.94 mg·g-1)和京尼平苷酸(11.13 mg·g-1)含量最高，且显著高于7个红叶杜仲叶片含量，1号和6号杜仲叶片桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸含量也较高；5号杜仲叶片绿原酸含量达到了74.76 mg·g-1，显著高于其他杜仲叶片，其次是3号(63.24 mg·g-1)；京尼平苷含量以5号(1.82 mg·g-1)和4号杜仲叶片(1.81 mg·g-1)最高，且显著高于其他6个杜仲叶片中含量；1号杜仲叶片总黄酮含量(28.37 mg·g-1)最高，且显著高于其他7个杜仲叶片中含量；总活性成分含量以5号杜仲叶片(119.45 mg·g-1)最高，其次是1号(107.54 mg·g-1)和3号(106.11 mg·g-1)。

3 讨论

叶片细胞色素种类、分布及含量是影响彩叶植物叶片呈色的重要因素，同时，光照、温度、矿质营养及水分等环境因子对叶色变化也有重要影响[12]。本研究试验材料均取自同一地点，立地及管理条件相一致，因此，叶片呈色差异可能是受色素种类、分布及含量的影响。李亚蒙等[13]研究发现，叶片中花色苷的分布对叶片呈色有重要的影响，叶片不同组织中，花色苷的分布范围存在差异，导致叶片外观上呈现一定的差异。本研究通过对7个变异红叶和1个绿叶(CK)杜仲叶片解剖结构观察发现，1、2、4和7号杜仲叶片花色苷集中分布于栅栏组织中，但是分布范围有一定的差异，2和7号分布范围较广，其叶片颜色相对于1、4号颜色较深；3、5和6号杜仲叶片花色苷在栅栏组织中分布较多，下表皮也有有少量分布，因此叶片正面和背面均呈现红色。对照杜仲叶片花色苷分布少，且栅栏组织和海绵组织叶绿素较多，故叶片正面、背面均呈绿色。

张敏等[14]研究发现，叶片颜色受CCar/CT值和CF/CT值综合影响，2个比值均较小时，叶片呈绿色；当CF/CT值增加占优势时，叶片呈红色或紫红色；当CCar/CT值增加占优势时，叶片呈黄色。本研究中，通过对7个红叶和1个绿叶(CK)杜仲叶片叶绿素、类胡萝卜素和花色苷的含量进行测定，发现红叶杜仲叶片花色苷含量、CCar/CT值以及CF/CT值都显著高于对照杜仲叶片，而叶绿素含量显著低于对照杜仲叶片，且红叶杜仲叶片CF/CT值较CCar/CT值高，占据优势，是红叶杜仲叶片呈色的主要原因。该结论与胡敬志在枫香因CF/CT值较高而使叶片呈红色的研究相一致[15]。此外，5、6和7号杜仲叶片花色苷含量以及CF/CT值明显高于其他红叶杜仲，因此其叶片颜色较其他杜仲叶片深，呈现紫红色。

杜仲叶片已被2005版《中国药典》(一部)收录为杜仲药材，通过对杜仲叶片中活性成分含量测定，发现7个红叶杜仲叶片各活性成分及总活性成分含量均较高，具有较高的药用价值。1、3、5和7号杜仲叶片总活性成分含量明显高于其他杜仲叶片。红叶杜仲叶片绿原酸、京尼平苷、总黄酮含量均明显高于对照杜仲叶片，其中，3和5号杜仲叶片绿原酸含量是对照杜仲叶片的2倍多，含量极高，开发利用价值很大。红叶杜仲叶片中较高的活性成分含量有助于提高杜仲药材的品质。在今后叶用杜仲育种及栽培工作中，应加大对红叶杜仲的研究，充分发挥红叶杜仲具有的独特的观赏价值和药用价值。

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National “twelve five” scienticific and technological project(2012BAD21B0502)

introduction：DU Qing-Xin(1991—),male,Master,Non-timber Forest Research and Development Center of Chinese Academy of Forestry.

date:2017-01-06

PigmentsandActiveIngredientsinLeavesofSevenEucommiaulmoidesVariation-types

DU Qing-Xin1,2QING Jun1,2ZHU Jing-Le1,2DU Hong-Yan1,2DU Lan-Ying1,2*

(1.Non-timber Forest Research and Development Center of Chinese Academy of Forestry,Zhengzhou 450003；2.The Eucommia Engineering Research Center of National Forestry Administration,Zhengzhou 450003)

The experiment was conducted to investigate the formation reasons for different colors and the active ingredients content of red leafEucommiaulmoidesvariation-types. With seven red leafE.ulmoidesvariation-types and one green leafE.ulmoides, the color, pigments distribution and content, and active ingredients content in leaf were determined. The front of blade was dark red or purple red of seven red leafE.ulmoidesvariation-types, and the palisade tissue was red or dark red. The backs of No.3, 5 and 6 were red with red lower epidermis, and those of No.1, 2, 4 and 7 were green with transparent lower epidermis. The contents ofCa,CbandCTin seven red leaf were lower than those of in control check leaf, whileCCar,CFcontent and the value ofCCar/CTandCF/CTwere significantly higher than those of in control check leaf, and there were the differences of pigment content between seven red leaf. Five kinds of active ingredients content were high in seven red lea, and the contents of chlorogenic acid, geniposide, and total flavonoids were higher than those of in control check. The distribution and content ofCFand the value ofCF/CTwere the main reasons for different colors of seven red leaf, and the high content of active ingredients made it of great potential in the utilization of medicine. This study would provide materials for ornamental and medicineE.ulmoidesresources.

red leafEucommiaulmoidesvariation-types;leaf;pigments;active ingredients

国家“十二五”科技支撑计划(2012BAD21B0502)

杜庆鑫(1991—)，男，硕士研究生，主要从事杜仲育种与栽培。

* 通信作者： E-mail：dly371@126.com

2017-01-06

* Corresponding author：E-mail：dly371@126.com

Q949.751.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.03.019