利用pmi标记基因筛选培育转EaDREB2B基因甘蔗
2017-11-10张木清
吴 杨 贺 俐 黄 勇 张木清
(1.井冈山大学生命科学院,吉安 343009; 2.福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室,福州 350002)
利用pmi标记基因筛选培育转EaDREB2B基因甘蔗
吴 杨1,2贺 俐1黄 勇1张木清2
(1.井冈山大学生命科学院,吉安 343009;2.福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室,福州 350002)
利用已构建的植物表达载体prd29a-dreb-hyg,通过酶切连接到含有磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)的表达质粒pZMLR14上,构建植物表达载体pDREB-PMI。利用基因枪轰击转化甘蔗愈伤,经过甘露糖筛选,共获51株抗性苗,转化再生频率为4.25%。对转基因植株进行分子检测,结果表明有8株为阳性转基因无性系。氯酚红试验表明标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因株系中均有表达。对转基因T1代甘蔗植株进行分子检测,结果表明EaDREB2B基因在转基因甘蔗无性系T1代中稳定遗传。该结果为进一步研究EaDREB2B基因在甘蔗抗旱方面的作用奠定了基础。
甘蔗;pmi基因;甘露糖
甘蔗是世界上最重要的糖料作物,但干旱是造成我国甘蔗单产低、品质差的主要原因之一。根据发达国家的生产实践证明,选育抗旱性强、水分利用率高的作物或品种是提高农业水分效率的最有效措施之一[1]。甘蔗无性繁殖,高度多倍性,遗传背景复杂的特点使其利用常规杂交育种方法实现遗传改良十分困难。植物基因工程技术的发展为解决这一困难提供了新途径,使在优良品种中导入目的基因进行品种遗传改良成为可能[2~3]。同时,甘蔗在世界上大部分地区不开花,转基因植株所带来的抗性基因不会随花粉发生“基因漂流”而对环境造成危害,而且作为生产蔗糖和乙醇的工业原料,经高温炼煮,用外源转基因技术培育的甘蔗新品种对环境和食品基本没有潜在威胁,因此也是理想的开展转基因育种的作物。
转录因子DREB是AP2/EREBP(APETALA2/ethylene responsive element binding protein)基因家族的一个亚家族,在胁迫应答基因表达中起着重要作用。自Stockinger等[4]从拟南芥中分离出编码DRE结合蛋白的cDNA以来,已经从多种植物中分离出许多基因。研究表明,利用转录因子提高植物抗逆性,能获得较为理想的效果,一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达[5]。逆境条件下,过表达转DREB基因植株,脯氨酸含量、可溶性糖明显高于对照,说明过表达的DREB类转录因子能够调控下游基因,并且与游离脯氨酸、可溶性糖等功能蛋白基因的合成有关,进而提高转基因株系的抗逆能力[6]。李墨野等[7]通过对转LbDREB基因大青杨的研究发现,干旱胁迫下转基因各株系在生长和生理指标上较对照具有明显优势,且LbDREB基因瞬时表达显著升高,转基因植株的抗旱性显著增强。Chen[8]等在绿豆中克隆得到一个DREB2A基因(VrDREB2A),过表达该基因可以增强玉米的抗热性。Mizoi等[9]从大豆中分离得到一个新的DREB2基因(GmDREB2A;2),该基因在干旱胁迫下具有较高的转录活性,在转基因拟南芥中能调控大量胁迫基因的表达,从而显著增强植物的抗旱性。
目前在甘蔗遗传转化中广泛应用的标记基因有抗除草剂和抗生素基因,但是这两类基因对生态环境和人类健康潜在的安全性问题越来越引起全世界的关注,制约着转基因甘蔗的商业化生产。因此,开发利用安全的筛选体系对甘蔗遗传转化具有非常重要的现实意义。以糖代谢酶基因磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)基因为筛选标记的方法,对人体健康和环境安全无危害[10]。磷酸甘露糖异构酶基因来自大肠杆菌,自然界中除肉桂和大多数豆类含有磷酸甘露糖异构酶基因外大多数植物都不含有该基因[11],但在细菌、酵母、动物及人体中磷酸甘露糖异构酶基因广泛存在,目前已经从这些生物中克隆到Pmi基因。将6-磷酸甘露糖转变为磷酸果糖[12],在以甘露糖为单一碳源的培养基上,转化子可以正常生长,非转化子因为无法利用甘露糖不能正常生长[13]。自从1998年Joersbo等将PMI/甘露糖阳性筛选系统用于筛选甜菜转基因植物以来,现已用于不同植物遗传转化筛选中[14~15]。
为了获得抗旱且对环境安全的转基因甘蔗,本研究以福建农林大学甘蔗研究所选育的早熟高糖高产品种福农95-1702为材料,利用从甘蔗近缘属斑茅中克隆得到的EaDREB2B基因构建以pmi基因(manA)为选择标记基因的植物表达载体,遗传转化甘蔗愈伤组织,以期培育出抗旱行强且对环境具有安全性的转基因甘蔗无性系。
1 材料和方法
1.1 材料
甘蔗品种福农95-1702(SaccharumofficinarumL.)由福建农林大学甘蔗研究所提供。大肠杆菌(E.coli)DH5α由农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室提供。真核表达载体pZMLR14由福建农林大学农业部甘蔗遗传改良与生理生态重点开放实验室提供;pRd29a-dreb-hyg植物表达载体为本实验室构建保存;用于本研究的其他工具酶和生化试剂等购自上海生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 植物表达载体pDREB-PMI的构建
将构建好的pRd29a-dreb-hyg表达载体用HindⅢ进行酶切,回收纯化含EaDREB2B基因的表达框,连接到用同样内切酶切开的载体pZMLR14中。转化感受态大肠杆菌DH5α后,利用氨苄青霉素筛选阳性克隆,随机挑取单菌落接种于300 μL含80 mg·L-1氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃ 150 r·min-1过夜培养。以10 μL菌液为模板,在EaDREB2B基因上设计引物DP1:5′-CCAAGGAGATGGAGTTAGAG-3′,DP2:5′-GAATCATTACCACCAGGCT-3′,两引物之间片段大小约为650 bp,检测EaDREB2B基因是否插入到表达载体中,在此基础上提取质粒并用HindⅢ进行酶切以验证表达载体构建的正确性。
1.2.2 甘露糖对甘蔗愈伤组织分化的影响
选取生长旺盛、直径约2 mm的愈伤组织块为试验材料,接种到不同质量浓度甘露糖和蔗糖配比的分化培养基中,每个试验浓度接种3瓶,每瓶15块材料。设置6种甘露糖和蔗糖的质量配比,记录分析甘蔗愈伤分化对甘露糖的敏感性。设定甘露糖和蔗糖的总含量为30 g·L-1,甘露糖的质量浓度分别为0、1、2、3、4和5 g·L-1。35天后观察统计愈伤的分化情况,选择最佳的甘露糖筛选浓度。
1.2.3 甘露糖对甘蔗无菌苗生根的影响
选取生长旺盛长势一致,株高4~5 cm的分化苗为试验材料,接种到含有不同质量浓度(同1.2.2)甘露糖的生根培养基中,每个试验浓度接种3瓶,每瓶15棵苗。35天后观察统计无菌苗生根情况,确定甘蔗无菌苗生根培养基中的甘露糖最佳筛选浓度。
1.2.4 甘蔗的遗传转化
本试验采用基因枪转化法,轰击前挑选生长旺盛的甘蔗胚性愈伤组织接种于高渗培养基(MS+2 mg·L-12,4-D+0.2 mol·L-1山梨醇+0.2 mol·L-1甘露醇+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼脂粉,pH5.8)中进行预处理。基因枪为Bio-Rad公司PDS-1000/He型,轰击前将预处理的愈伤组织集中在培养皿的中心位置,每皿轰击1次。本研究选择28英寸汞柱真空度,1 100 psi的轰击压力和6 cm的轰击距离作为轰击参数。具体步骤参照仪器操作说明书进行。轰击后将愈伤组织继续渗透处理18h,然后转接至不含甘露糖的继代培养基中,28℃暗培养1周,最后接种到诱导不定芽的甘露糖筛选培养基上进行筛选,待不定芽长至2 cm时接到添加最适浓度甘露糖的生根培养基中进行生根培养。
1.2.5 转化植株的分子检测
PCR检测:采用CTAB法提取甘蔗基因组DNA,在rd29A启动子区域设计上游引物S1:5′-CGTGTCCCTTTATCTCTCTCAGTC-3′和目的基因处设计下游引物S2:5′-CCTTTACCTTTCATACAGCCTTTC-3′,两引物之间片段大小为364 bp,反应条件为:94℃预变性3 min;94℃变性40 s,59℃退火40 s,72℃延伸50 s,循环40次;72℃延伸反应7 min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳,在成像系统下拍照分析。
点杂交检测:提取PCR扩增呈阳性的甘蔗植物总DNA作模板,采用地高辛标法对探针进行标记,具体操作方法参照Roche DNA Labeling and Detection Kit杂交试剂盒说明书进行。
RT-PCR检测:参照Invitrogen Trizol Reagent RNA提取试剂盒方法提取叶片总RNA,采用TakaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0试剂盒进行RNA反转录,得到cDNA,使用引物DP1、DP2进行扩增检测。
1.2.6 转基因甘蔗的氯酚红检测
配制1/2MS+3 g·L-1甘露糖+50 g·L-1氯酚红溶液,过滤灭菌后滴至无菌的2 mL离心管中,并分别放入面积、鲜质量相当,苗龄相同的转基因叶片和非转基因对照叶片,密封后置于27℃培养箱,暗培养4 d后观察氯酚红溶液颜色的变化,具体操作方法参照文献进行[16]。
2 结果与分析
2.1植物表达载体pDREB-PMI的构建及重组鉴定
将prd29a-dreb-hyg质粒用HindⅢ酶切,通过琼脂糖电泳回收DREB基因整个表达框;同时利用HindⅢ酶切pZMLR14表达载体把环状表达载体打开,电泳回收载体片段。将线性DREB表达框和切开后pZMLR14表达载体相连接,产物转化大肠杆菌DH5α,利用基因特异性引物进行菌液PCR鉴定,结果如图1所示,重组表达载体扩增条带大小约为650 bp,与预期结果一致;将得到的阳性重组菌提取质粒后,经HindⅢ酶切电泳后,得到大小约为1 920 bp的片段,与预期一致(图2)。由此可以证明pDREB-PMI植物表达载体构建成功。
图1 重组菌pDREB-PMI的PCR鉴定 M. DL2000(TakaRa);1.阳性对照(质粒DNA);2.空白对照;3~16.重组菌Fig.1 PCR Identification of Recombinant bacteria pDREB-PMI M. DL2000(TakaRa); 1.Plasmid DNA(Postive control); 2.Blank control; 3-17.Recombinant bacteria
图2 植物表达载体pDREB-PMI酶切鉴定M.TaKaRa Wide Range DNA Marker (500~12 000);1,3.重组质粒pDREB-PMI/HindⅢ;2,4.重组质粒Fig.2 Identification of plant expression vector pDREB-PMI by restriction digestionM.TaKaRa Wide Range DNA Marker (500~12 000); 1,3.Recombinant plasmid pDREB-PMI/HindⅢ; 2,4.Recombinant plasmid
2.2 甘蔗对甘露糖的敏感性试验
2.2.1 甘露糖浓度对甘蔗愈伤组织分化的影响
为了有效筛选出转化植株,淘汰非转化植物,选取生长旺盛、直径约2 mm的甘蔗愈伤组织块接种到不同质量浓度甘露糖和蔗糖配比的分化培养基中,通过观察愈伤组织分化情况确定甘露糖的临界耐受浓度。结果如图3,当甘露糖质量浓度为1 g·L-1时,愈伤组织分化正常。甘露糖质量浓度为2 g·L-1时,愈伤组织分化受到了严重影响, 只看到少量绿色芽点。甘露糖质量浓度为3 g·L-1时,少量分化的外植体后期黄化死亡。为此,选择3 g·L-1的甘露糖浓度用于甘蔗遗传转化分化阶段的选择压。
2.2.2 甘露糖浓度对甘蔗无菌苗生根的影响
甘露糖能抑制无菌苗生根,转化植株在含有甘露糖的培养基上正常生根,非转化植株将不能生根死亡。为了有效筛选抗性植株,将无菌苗茎段接种到不同质量浓度的甘露糖和蔗糖培养基中。通过观察甘蔗无菌苗生根情况确定甘露糖的临界耐受浓度。结果如图4,当甘露糖质量浓度为1或2 g·L-1时,无菌苗能长出新根。当甘露糖质量浓度为3 g·L-1时,无菌苗生根受到抑制。随着甘露糖质量浓度的不断增加,根系无法生长,叶片开始变黄,基部也开始褐化。为此,本研究在进行促根筛选时,以3 g·L-1甘露糖作为筛选浓度。
图3 甘露糖浓度对甘蔗愈伤组织分化的影响Fig.3 Results of callus differentiation under different mannose selection pressures
图4 生根培养对甘露糖的敏感性Fig.4 Results of rooting under different mannose selection pressures
2.3 转化植株的检测
2.3.1 转化植株的PCR检测
利用基因枪转化技术,共轰击15个培养皿1 200个愈伤组织块,获得51株幼苗,转化再生频率为4.25%。对筛选获得的抗性植株分别提取叶片DNA,进行目的基因的PCR检测。结果有8株扩增出预期大小的特异性条带,与质粒扩增的条带大小相同,而非转化植株对照植株中未扩增出相应的条带(图5)。初步证明外源EaDREB2B基因已整合到甘蔗基因组中。
图5 转化植株的PCR检测 M. 250 bp DNA Ladder Marker(TakaRa);1.质粒DNA(阳性对照);2.空白对照;3.未转化植株(阴性对照);4~17.转化甘蔗植株Fig.5 The PCR detection of transformed sugarcane M. 250 bp DNA Ladder Marker(TakaRa); 1.Plasmid DNA(Positive control); 2.Blank control; 3.Nontransformed sugarcane(negative control); 4-17.Transformed sugarcane
2.3.2 转化植株的点杂交(Dot-blotting)检测
为了进一步确定目的片段整合到甘蔗基因组中,以pDREB-PMI植物表达载体质粒DNA为模板,利用PCR检测引物对其进行扩增,将获得的产物片段回收纯化用作杂交探针,对8株PCR呈阳性的转化植株进行点杂交分析,为了增强实验结果的可靠性,在进行杂交分析时,选取2个PCR检测呈阴性的非转基因抗性植株作为质控点(图6)。8株阳性植株都出现和质粒对照一样的杂交信号,表明目的片段已整合到甘蔗基因组中。
图6 转化植株的点杂交分析1.质粒;2.未转基因甘蔗;3~12.抗性转化植株 3~4、6~7、9~12. PCR检测阳性植株Fig.6 Dot blotting analysis of transformed sugarcane1.Plasmid; 2.Non-transgenic sugarcane; 3-12.Putative transgenic sugarcane
2.3.3 转基因甘蔗的RT-PCR检测
为了检测干旱胁迫下转基因甘蔗中EaDREB2B基因能否在诱导型启动子rd29A的驱动下转录表达,本实验将点杂交呈阳性的转基因植株进行干旱胁迫后,对其叶片提取RNA后进行RT-PCR分析。鉴定结果表明(图7):在干旱胁迫下,转基因甘蔗中的EaDREB2B基因均能在转录水平上表达。
图7 转基因甘蔗的RT-PCR分析M. DL2000 Marker(TakaRa);P.质粒;B.空白对照;CK.未转基因甘蔗;1~8.转基因甘蔗Fig.7 RT-PCR analysis of the EaDREB2B expression in transgenic sugarcaneM.DL2000 Marker(TakaRa);P.Plasmid;B.Blank control;CK.Untransformed sugarcane(negative control);1-8.Transformed sugarcane
2.3.4 转基因甘蔗的氯酚红(CPR)检测
氯酚红染色培养4 d天后观察实验结果(图8)表明:在含有甘露糖的液体培养基中,8个转基因无性系叶片呈现阳性反应,培养基颜色发生变化,呈现黄色,在不含有甘露糖的液体培养基中颜色未发生改变。实验结果说明8个转基因无性系具有PMI活性,pmi基因不仅可以作为一种选择标记基因,而且还完全可以象Gus基因一样,作为转基因植株的报告基因,因此pmi基因作为一种标记基因,不仅安全,而且检测方便,可以减少假阳性植株。
图8 转基因甘蔗叶片的氯酚红(CPR)分析 CK1.未转化的组培苗;CK2.空白对照;1~8.待检测的转基因植株 第1排液体培养基中含有3 g·L-1甘露糖;第2排液体培养基中不含甘露糖Fig.8 Chlorophenol red asasy of transgenic sugarcane leaf CK1.Nontransformed tissue culture sugarcane;CK2.Blank control;1-8.Transformed sugarcane
图9 第一代转基因甘蔗EaDREB2B基因的PCR检测 M.DL2000 Marker(TakaRa);1.质粒DNA(阳性对照);2.空白对照;3.未转化植株(阴性对照);4~17.转化甘蔗植株Fig.9 The PCR detection of EaDREB2B gene in first generation of transgenci sugarcane M.DL2000 Marker(TakaRa);1.Plasmid DNA(Positive control);2.Blank control;3.Nontransformed sugarcane(negative control);4-17:Transformed sugarcane
图10 第一代转基因甘蔗EaDREB2B基因的RT-PCR检测 M.DL2000 Marker(TakaRa);P.质粒DNA;B.空白对照;CK.未转化甘蔗;1~8.转基因甘蔗Fig.10 RT-PCR detection of EaDREB2B gene in first generation of transgenic sugarcane M.DL2000 Marker(TakaRa);P.Plasmid DNA;B.Blank control;CK.nontransformed sugarcane;1-8.Transgenic sugarcane
2.3.5转基因甘蔗后代中EaDREB2B基因的遗传稳定性
对转基因T1代甘蔗植株遗传检测直接采用PCR扩增外源EaDREB2B基因,电泳结果显示(图9):在转基因甘蔗中仍能检测到EaDREB2B基因,而在非转基因甘蔗中未检测到目的条带;同时,本研究取胁迫处理下T1代各无性系的叶片提取RNA,进行RT-PCR分析,电泳结果显示(图10):8个样品都扩增出阳性目的的条带。以上结果表明EaDREB2B基因在转基因甘蔗无性系T1代中稳定遗传。
3 讨论
目前使用的抗性标记基因大多数是抗生素或除草剂抗性基因。当目的基因导入植物基因组后,标记基因就完成了使命[17~18]。随着转基因植物的商品化,抗性标记基因潜在的生态和食用安全性倍受关注。植物体内的标记基因持久表达不仅给植物生长发育产生抑制作用,而且给其它有利性状基因的表达带来不确定的影响。对于环境释放或商品化生产的转基因植物而言,人们担心标记基因的抗性迁移会给目前使用的抗生素和除草剂带来挑战。尽管目前没有关于标记基因迁移带来危害的报道[19],但抗性标记基因潜在的生态环境和食用安全性一直颇具争议,人们对转基因作物的这些担心依旧是制约转基因作物发展的一个因素。
就转基因安全而言,大力发展正向筛选系统,使用对生物安全的非抗性标记基因是最为有效的办法[20]。目前,磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)作为有效的正向选择体系的安全标记基因,已经在果树、水稻、棉花及番茄的遗传转化筛选中得到了应用。Reed等[10]对转基因玉米和甜菜中pmi基因所编码的蛋白质进行了全面的分析,认为甘露糖筛选体系对人体健康和环境十分安全,世界上30多个独立科学委员会已认可pmi基因的安全性[21]。本实验通过甘露糖对甘蔗愈伤组织分化及无菌苗生根的影响,建立了甘蔗以甘露糖为筛选标记的转化体系。从实验结果来看,通过甘露糖筛选共获51株抗性苗,经分子检测其中8株为阳性转化植株,多为假阳性植株,阳性检出率较低,不排除有其他因素,筛选压也有待于进一步优化。此外,本实验pmi基因的表达情况能通过氯酚红由紫红色变为黄色的颜色变化来定性检测,与传统分子杂交相比,该方法具有操作简便、快捷、经济高效等优点。因此,除作为标记基因外,pmi基因还可在一定程度上行使报告基因的功能。
本研究成功构建含pmi标记基因的植物表达载体,遗传转化甘蔗后经分子检测结果表明,EaDREB2B基因已经整合到甘蔗基因组中,并在转基因甘蔗无性系T1代中稳定遗传。本实验为更好的利用该标记基因提高转基因甘蔗的安全性奠定基础,同时对进一步研究EaDREB2B基因在提高甘蔗抗旱性方面奠定了基础。
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The science and technology support project of Jiangxi Province(20122BBF60135);The science foundation of Jiangxi Provincial education department(GJJ13543)
introduction:WU Yang(1980—),male,doctor,associate professor,major in plant stress physiology and molecular biology.
date:2016-11-14
TransformationofEaDREB2BGeneintoSugarcaneUsingpmiGeneasSelectableMarker
WU Yang1,2HE Li1HUANG Yong1ZHANG Mu-Qing2
(1.School of Life Sceinces,Jinggangshan University,Ji’an 343009;2.Ministry of Agriculture Key Lab of Eco-physiology and Genetic Improvement for Sugarcane,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002)
The plant expression vector of pDREB-PMI was constructed successfully with expression vector of prd29a-dreb-hyg and pZMLR14 by restriction-ligase reaction. Sugarcane callus were transformed with pDREB-PMI expression vector by bombardment. After mannose selection, 51 regenerated plants were obtained with the transformation rate of 4.25%. All of these 51 seedlings were detected with molecular detection, and the 8 seedlings were positive transgenic sugarcane. Chlorophenol red assay of transgenic sugarcane leaf showed that thepmigene was expressed in transgenic plants. T1-generation transgenic sugarcane were detected by PCR and RT-PCR, and the exogenous geneEaDREB2Bwas stably inherited. The results laid the foundation of further research on the effect ofEaDREB2Bgene in improving sugarcane resistance to drought stress.
sugarcane;pmigene;mannose
江西省科技厅科技支撑计划项目(20122BBF60135);江西省教育厅科技计划项目(GJJ13543)
吴杨(1980—),男,博士,副教授,主要从事植物逆境生理与分子生物学研究。
* 通信作者:E-mail:wuyangfenghao@163.com
2016-11-14
* Corresponding author:E-mail:wuyangfenghao@163.com
S566.1
A
10.7525/j.issn.1673-5102.2017.03.007