小球藻亲环蛋白A的酶活性及过表达拟南芥抗盐性分析

廖 栩 何明良 张素艳 马海燕 王旭辉 罗秋香 管清杰*

(1.东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040； 2.吉林省德惠市第九中学，德惠 130300)

小球藻亲环蛋白A的酶活性及过表达拟南芥抗盐性分析

廖 栩1何明良1张素艳2马海燕1王旭辉1罗秋香1管清杰1*

(1.东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2.吉林省德惠市第九中学，德惠 130300)

在前期研究中分离到噬碳酸盐小球藻(Chlorellasp. X1)的亲环蛋白基因CsCyp1A(登录号：KY207381)，编码CsCyp1A蛋白是否具有肽酰脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性功能是进一步研究它参与小球藻耐盐生物学过程的基础。通过His标签的pQE-30-CsCyp1A原核蛋白表达载体，经IPTG诱导它的E.coliM15菌株表达融合蛋白，Nitra-柱纯化后获得纯化的30 kDa左右的His-CsCyp1A融合蛋白质，Western杂交检测到HisCsCyp1A蛋白的杂交信号。酶活性分析显示，HisCsCyp1A融合蛋白中生色基团的产生速度明显快于对照，表明CsCyp1A蛋白可以催化底物N-succinyl-Xaa-Pro-Phe-p-nitroanilide中Xaa-Pro肽键的顺反折叠，说明纯化的CsCyp1A蛋白具有PPIase活性。典型的亲环蛋白家族成员具有肽酰脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性，参与折叠和转运、信号转导、免疫调节、细胞凋亡等生物学过程。真空渗入法侵染转化的拟南芥在35S启动子驱动下超表达CsCyp1A基因，耐盐性研究表明它提高了过表达株系对NaCl胁迫的耐性，揭示小球藻CsCyp1A基因的抗盐性功能，它将成为抗逆育种的基因资源。本研究也为探索小球藻亲环蛋白A的抗盐碱胁迫生物学作用和分子育种奠定了基础。

噬碳酸盐小球藻；盐碱地；亲环蛋白A；肽脯氨酰顺反异构酶；原核表达蛋白

亲环蛋白(cyclophilin)具有Lys118-His126环以及4条β折叠片(3～6)所形成的袋状结构，是环孢霉素A特异的结合位点，是作为免疫抑制剂CsA的细胞内受体被发现的[1]。Handschum-acher等人在小牛胸腺组织中发现亲环蛋白A(cyclophilin A,CypA)[2]，研究表明，CypA的免疫抑制剂的特异性受体普遍存在于生物体内。人类Cyp1A的二级结构主要为β折叠片，此外还伴有α螺旋以及无规卷曲结构。在1989年，德国和日本的研究小组发现CypA具有肽酰脯氨酰顺反异构酶(Peptide acyl preserved ammonia acyl cis-trans isomerase，PPIase)活性，能够催化Xaa-Pro的顺反异构[3～4]，在蛋白的折叠、运输以及蛋白间的相互作用中发挥重要的作用。池蝶蚌CyPA是一个既参与免疫应激又对细胞的生长发育具有影响的功能广泛的蛋白质[5]。有些CyPs可以作为分子伴侣，在应激反应中参与信号转导，并影响RNA的剪接过程[6]。在拟南芥中，有29个亲环素基因，其中有14个已被报导，其功能涵盖了剪接、光合作用和植物的抗逆反应[7]。发现油桃的3个CYP707A家族成员中的PpCYP707A2可以被ABA和GA诱导，而且三者交叉调控花芽休眠的进程[8]。到目前为止，拟南芥[7]、盐芥[9]、水稻[10]、棉花[11]、木豆等的CyPs与非生物胁迫调节相关研究已有报道，OsCyp2参与到了水稻侧根发生的整个过程，促进生长[10]。梁凌星等在研究杧果防治农业病虫害的生产实践中，敲除CYP51基因的杧果对咪鲜胺的敏感性存在极显著差异，说明了CYP51基因对咪鲜胺产生抗药性[12]。过表达CcCyP拟南芥的PPIase活性显著提高，增加了对多种非生物胁迫耐性[13]。典型的亲环蛋白家族成员具有肽酰脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性，参与折叠和转运、信号转导、免疫调节、细胞凋亡等生物学过程。未见能够在极端苏打盐渍土壤中生存的小球藻CyPs的报道，小球藻(Chlorellasp. X1)是从松嫩苏打盐碱土壤中分离到的，在400 mmol·L-1NaHCO3的培养液中快速生长，充分显示了它噬碱性盐的特性[14]，过表达其CsCyp1A基因的酵母高抗盐碱胁迫[15]。土壤盐碱化造成农牧业的巨大损失，在松嫩平原上盐碱地有373×104公顷[16]。随着人口的越来越多，粮食短缺，可耕地减少。为了盐碱地成为后备耕地将进行综合的生态研究，首先从改良其土壤性质入手，其次利用耐性植物综合治理[17]。那么通过筛选和转基因技术培育耐盐碱品种，耐性基因的挖掘就显得尤为重要。本研究对噬碱性盐小球藻亲环蛋白A(CsCyp1A)的结构进生物信息分析，构建体外原核表达载体，摸索诱导表达纯化条件，检测其亲环蛋白A是否具有肽酰脯氨酰顺反异构酶活性功能是进一步研究它参与小球藻耐盐生物学过程的基础。深入研究过表达CsCyp1A基因拟南芥对盐胁迫的耐受性，将为促进亲免蛋白A的生物学研究和应用提供实验依据，也对研究盐碱地小球藻噬碳酸盐胁迫的生理机制具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与载体

大肠杆菌(E.coli)M15；pMD18-T-CsCyp1A质粒DNA及pQE-30原核表达载体由本实验室保存。

1.1.2 试剂

Ex-Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ，及T4DNA连接酶购自Fermentas公司；N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide和Ni-agarose蛋白质纯化柱子购自Sigma公司；His标签的一抗和鼠抗兔的二抗，均购买于碧云天生物技术研究所；DIG标记物和CDP-Star购自Roche公司；其他试剂为中国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 小球藻亲环蛋白A(CsCyp1A)结构分析

为了进一步研究从噬碱性盐小球藻克隆到的基因，其ORF编码蛋白的结构功能[15]，应用SMART网络软件(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)分析小球藻CsCyp1A基因(登录号：KY207381)推导氨基酸的功能结构域，预测该基因所表达的蛋白质功能。

1.2.2 pQE-30-CsCyp1A融合表达载体的构建

以测序完全正确的pMD18-T-CsCyp1A质粒DNA的1%为模板，应用增设BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的特异引物(CsCyp1A-F：5′-ggatccatgggtgccggtgcaag-3′和CsCyp1A-R：5′-gtcgactagagccctgcaaactgagc-3′)进行PCR扩增，再连入pMD18-T载体于E.coliJM109中克隆质粒DNA，再经BamHⅠ和SalⅠ酶切其目的基因质粒和pQE-30载体DNA，回收胶中目的DNA、连接和转化，进一步酶切鉴定完成pQE-30-CsCyp1A载体的构建。

1.2.3 HisCsCyp1A融合蛋白的诱导表达与纯化

1.2.3.1 HisCsCyp1A融合蛋白小量诱导表达

构建的pQE-30-CsCyp1A质粒DNA所热激转化至M15菌株，阳性单克隆接种于5 mL含有100 mg·L-1Amp+25 mg·L-1Kana的LB液体培养基中，37℃过夜培养至菌液ODλ=600=0.3～0.5，开始小量诱导表达，以YT为诱导培养基，30℃下，1 mmol·L-1IPTG诱导时间梯度为：0 hr(空白对照)，1、2、3和4 hr。离心收集菌体加入10 mmol·L-1咪唑裂解缓冲液和2×Loading Buffer各200 μL，煮沸变性，取15 μL样品进行SDS-PAGE凝胶电泳后，以考马斯亮蓝R250进行凝胶染色。

1.2.3.2 HisCsCyp1A融合蛋白大量诱导与纯化

在含有100 mg·L-1Amp+25 mg·L-1Kana的500 mL LB培养基中，于37℃摇床振荡培养表达HisCsCyp1A融合蛋白的菌株，当ODλ=600为0.3～0.5，加入1 mmol·L-1IPTG于30℃诱导融合蛋白的大量表达3 h，收集菌体细胞在超声波下进行破碎，离心，收集蛋白上清液加入400 μL Ni-agarose蛋白纯化柱中，通过吸附柱的结合作用，洗涤杂蛋白，进行HisCsCyp1A融合蛋白纯化，并进行SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化蛋白。

1.2.3.3 Western杂交检测HisCsCyp1A融合蛋白

将未诱导(0 h)总蛋白和经IPTG诱导4 h的总蛋白，以及纯化的HisCsCyp1A融合蛋白10 μg样品，通过12.5%的SDS-PAGE凝胶电泳，半干转印法转膜，以His-Antibody为鼠一抗杂交，兔抗鼠的碱性磷酸酶标记的二抗，CDP-Star显色检测HisCsCyp1A融合蛋白的杂交信号。

1.2.4 CsCyp1A蛋白的PPIase酶活性检测

参照Fischer G,等测定重组CsCyp1A蛋白的PPIase活性的方法[18]。略有改动，总反应体系为1 mL：0.02 μmol·L-1纯化的蛋白加入到PPIase buffer(50 mmol·L-1Hepes,pH8.0,86 mmol·L-1NaCl)中，冰上放置1 hr；然后快速加入终浓度为1.2 mmol·L-1的糜蛋白酶(溶于10 mmol·L-1HCl)以及终浓度为60 μmol·L-1的底物(溶于三氟乙醇/470 mmol·L-1LiCl/N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)，混匀后放置于紫外分光光度计中，连续测定390 nm吸光值3 min，应用Excel分析数据并作折线图。

1.2.5 过表达CsCyp1A拟南芥的抗盐性检测

1.2.5.1转基因T1代株系的PCR检测

采用真空渗入法，以含有pCXSN-CsCyp1A质粒DNA的根癌农杆菌(EHA105)侵染转化拟南芥[19]，经潮霉素筛选得到的T1代和WT(野生型拟南芥)种子经消毒灭菌，播种在1/2MS含40 mg·L-1潮霉素的培养基上，发芽培养后，移栽到营养钵中，以CTAB法提取T1代(T1-#1，-#2，-#3)植株的叶片基因组DNA的1%作为模板，PCR检测外源CsCyp1A基因整合情况(35SF：5′-TCATTTCATTTGGAGAGAACAC-3′;NOSR:5′-ATCGGGGAAATTCGCTAGTG-3′)。继续潮霉素筛选培收获到T3代种子。用Trizol一步方法提取WT和T3代转基因植株(T3-#1，-#2，-#3)的总RNA，取5 μg经甲醛变性电泳，转膜，Nouthern杂交检测CsCyp1A基因的表达。

1.2.5.2转基因T3代株系对NaCl胁迫的耐性

取T3代株系(T3-#1，-#2，-#3)和WT种子灭菌后，播种在1/2MS平板上发芽7 d，将两叶期的不同转化株系以及WT幼苗植株移接到1/2MS+0(对照)、100、125、150 mmol·L-1NaCl的培养基上处理，培养于温度22～23℃，光照明/暗为16 hr/8 hr，实验设置3次重复，7天后观察植株的生长表型变化，调查植株的生长状况，测量根长以及植株的鲜重，并检测其MDA含量[20]，用Excel进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 小球藻亲环蛋白A(CsCyp1A)结构域

将克隆到的小球藻CsCyp1A基因推导编码的274个氨基酸输入SMART网络软件，运行分析发现其功能结构域(图1)：含有三个低螺旋区域(23～33，216～227，245～273 aa)和一个肽脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase)功能结构域(43～195 aa)，表明小球藻CsCyp1A基因编码的蛋白可能具有肽脯氨酰顺反异构酶功能。

图1 小球藻亲环蛋白A(CsCyp1A)功能结构域预测粉色为低复杂区域；灰色框图为肽脯氨酰顺反异构酶结构域Fig.1 The prediction of Chlorella Cyclophilin A’s(CsCyplA) functional structure area

2.2 His标签的原核表达载体的酶切鉴定

经BamHⅠ和SalⅠ双酶切的目的DNA与载体片段连接产物转化到E.coliJM109克隆菌株中，在37℃下，对提取pQE-30-CsCyp1A重组质粒DNA限制性内切酶鉴定，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果表明，有大小为850 bp的DNA插入片段(图2)，与目的基因大小相符，说明构建完成His标签融合蛋白的原核表达载体pQE-30-CsCyp1A。

图2 pQE30-CsCyp1A重组载体DNA酶切鉴定 M. DL2000 Marker；1～3. BamHⅠ，SalⅠ双酶切pQE30-CsCyp1A质粒DNAFig.2 Confirmation of the pQE30-CsCyp1A DNA plasmid M. DL2000 Marker; 1-3. pQE30-CsCyp1A cutted by restriction enzyme(BamHⅠ,SalⅠ)

2.3 HisCsCyp1A融合蛋白小量诱导表达

为了原核表达CsCyp1A蛋白，将pQE-30-CsCyp1A质粒DNA热激转化到E.coliM15，对Amp和Kana筛选下的阳性M15克隆菌株小量诱导表达融合蛋白，由12.5%的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果可以看出(图3)，在30℃下，经1 mmol·L-1IPTG不同时间诱导之后，导入pQE-30-CsCyp1A质粒的M15菌株随IPTG诱导时间(1～3 hr)的延长，表达的约为30 kDa融合蛋白增加明显，诱导4 hr反而表达蛋白下降。因此，说明HisCsCyp1A融合蛋白的最佳诱导条件是，诱导物为1 mmol·L-1IPTG，表达培养时间为3 hr。

图3 小量诱导表达HisCsCyp1A融合蛋白 M. Marker；0.转pQE-30-CsCyp1A质粒的菌株诱导0 min的总蛋白；1～4.转化pQE-30-CsCyp1A质粒的菌株相应诱导时间的总蛋白Fig.3 The expression of a small amount of induced HisCsCyp1A fusion protein M. Marker; 1. Transformed pQE-30-CsCyp1A vector,induced 0 min; 2-5. Transformed pQE-30-CsCyp1A vector,induced 1-4 h

2.4 HisCsCyp1A融合蛋白大量诱导表达与纯化

经过实验条件优化发现，在30℃条件下，1 mmol·L1IPTG诱导含有pQE-30-CsCyp1A重组载体的E.coliM15菌株3 hr，超声破碎细胞，获得的上清中HisCsCyp1A融合蛋白，上清蛋白溶液经Ni-agarose柱纯化目的蛋白，洗脱收集获得的蛋白质样品，通过12.5%SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图4所示，收集到纯化的HisCsCyp1A蛋白约为30 kDa，纯化蛋白的浓度为41.3 μg·mL-1，纯化的蛋白能够进行CsCyp1A蛋白的PPIase活性的检测及其蛋白相关特性的研究。

Western杂交检测HisCsCyp1A融合蛋白，为了进一步检测纯化的HisCsCyp1A融合蛋白，实验选取His抗体对其(图4A)进行Western杂交检测。DIG显色结果表明，在诱导的总蛋白以及纯化的上清蛋白中检测到杂交信号(图4B)，进一步验证含His标签的纯化蛋白在上清中，为下一步的酶活性分析准备了实验材料。

图4 HisCsCyp1A融合蛋白的纯化和Western杂交检测 a: M. Marker；1.转pQE-30-CsCyp1A质粒的菌株经IPTG诱导0 hr总蛋白；2.诱导3 hr的总蛋白；3.纯化的HisCsCyp1A融合蛋白 b. 以His抗体探针的Western杂交分析图Fig.4 Purification of HisCsCyp1A fusion protein and the detection by Western blot a: M. Marker；1. Transformed pQE-30-CsCyp1A vector which was non-induced by IPTG; 2. Transformed pQE-30-CsCyp1A vector which was induced 3 hr by IPTG; 3. HisCsCyp1A fusion protein b. Western blot analysis of His antibody probe

2.5 HisCsCyp1A融合蛋白PPIase酶活性

N-succinyl-Xaa-Pro-Phe-p-nitroanilide具有顺式构象和反式构象，通过Xaa-Pro肽键的顺反折叠使顺式结构和反式结构处于动态平衡，当多肽处于反式结构时，α-糜蛋白酶(α-Chymotrypsin)将C端封闭的基团裂解释放生色基团，生色基团可以在390 nm测得。实验表明(图5)，在底物中加入HisCsCyp1A融合蛋白后，生色基团的产生速度明显快于对照，表明HisCsCsCyp1A具有PPIase活性，其可以催化底物N-succinyl-Xaa-Pro-Phe-p-nitroanilide中Xaa-Pro肽键的顺反折叠，加速封闭基团裂解，表明纯化的HisCsCyp1A蛋白具有PPIase活性。具有肽酰脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性功能是进一步研究它参与小球藻耐盐生物学过程的基础。

图5 HisCsCyp1A融合蛋白PPIase活性测定 CK.对照样品在390 nm的吸光值；CsCyp1A.加入HisCsCyp1A融合蛋白样品在390 nm的吸光值Fig.5 Determination of PPIase activity of HisCsCyp1A fusion protein CK.The absorbance at 390 nm that the control; CsCyp1A.The absorbance at 390 nm that the sample add HisCsCyp1A fusion protein

2.6 过表达CsCyp1A基因的拟南芥抗盐性分析

2.6.1 过表达CsCyp1A拟南芥的分子检测

本研究PCR检测潮霉素筛选到的抗性株系(图6A)表明，转基因拟南芥(T1-#1,-#2,-#3)基因组整合了目的CsCyp1A基因(图6B)；通过Northern杂交分析CsCyp1A基因在拟南芥植株中的表达，结果显示转CsCyp1A基因拟南芥的三个株系(T3-#1,-#2,-#3)都有一条明显的信号条带，而野生型拟南芥(WT)没有检测到杂交信号(图6C)，表明CsCyp1A基因在转基因植株中成功的表达。通过潮霉素抗性筛选、基因组DNA的PCR扩增检测，以及Northern杂交鉴定表明收获的T3代植株种子成功的导入CsCyp1A基因，并且在35S启动下成功的表达，可以用于后续的抗盐性功能特性分析实验。

2.6.2 过表达CsCyp1A拟南芥耐NaCl分析

NaCl胁迫两叶期幼苗7天后，调查植株耐性生长表型：在对照培养基上，WT植株和转CsCyp1A基因植株生长状况良好(图7A)，无显著差别；而在NaCl胁迫处理下，植株的生长均明显受到抑制(图7：B-D)，但转基因植株的生长明显要优于WT植株；为了进一步说明NaCl胁迫对拟南芥植株生长的影响，我们测定了植株的根长、鲜重以及MDA含量的变化(图7:E-G)，结果表明，转基因植株的根长和鲜重高于野生型植株；MDA的含量测定表明过表达株系的含量低于WT株系。揭示了CsCyp1A基因在拟南芥中的过表达能够增强植株应对NaCl胁迫，提高耐性生长的能力。

图7 检测NaCl胁迫处理下过表达CsCyp1A拟南芥耐生长 a,b,c,d分别是WT和转基因T3代(#1,2,3)株系在1/2MS+0,100,125,150 mmol·L-1 NaCl肋迫下的生长表型；e.根长；f.鲜重；g.丙二醛含量Fig.7 The growth of Arabidopsis over-expressing CsCyp1A under NaCl stress a,b,c,d show phenotypes of CsCyp1A transgenic and WT lines subjected to 0, 100, 125 or 150 mmol·L-1 NaCl treatment, respectively; e, f and g show root length, fresh weight and MDA levels changes in CsCyp1A transgenic and WT lines

3 讨论

在盐碱环境下植物生理生态反应，分为植物的胁迫作用、耐性生长状况和对土壤生境的影响[21]。植物亲环蛋白家族成员具有多种生物学活性，目前研究表明，亲环蛋白的肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性作用是主要参与防御反应机制，能够催化蛋白质的折叠与装配[22]。亲环蛋白依据功能结构域分子量(18,21,23 kDa)的大小可划分为A、B、C和线粒体蛋白的D类型[23～24]。本研究通过与His的融合蛋白的小量诱导表达，His标签是6个组氨酸残基组成的，pH8.0时不带电荷，融合型表达载体自起始密码子开始翻译蛋白，并且是利用金属螯合层析柱子进行分离纯化的，易得到可溶性蛋白，亲和纯化产物纯度较高[25]。刘沛等用His-tag系统原核表达纯化到小麦TaMAPK2激酶可溶性蛋白并制备了抗体[26]，本研究构建了His-tag标签的pQE-30-CsCyp1A融合表达载体，以M15菌株来诱导表达并纯化出了HisCsCyp1A融合蛋白，获得30多kDa可溶性蛋白(图3)。Western杂交检测到上清中的蛋白与诱导表达总蛋白一致的杂交信号(图4)，表明表达的是融合蛋白。在X-Pro(X为除了Pro以外的氨基酸残基)结构中只有两种空间构象，一种是反式构象，一种是顺式构象[27]。亲环蛋白能够改变肽脯氨酰顺反式构象，而参与防御代谢反应，本研究以Xaa-Pro为底物检测纯化的HisCsCyp1A融合蛋白具有肽脯氨酰顺反异构酶的活性(图5)。本研究验证了克隆到的盐碱土壤中小球藻的CsCyp1A基因表达的蛋白是与原核的蓝细菌的4个亲环蛋白、真核的莱茵衣藻中的52个亲环蛋白、拟南芥中的52个亲免蛋白、水稻中的56个亲环蛋白[28～29]相同的酶，可能参与植物遭受胁迫伤害时激活自身的防御机制。盐碱地是由土壤、气候、地下水、植物、根际微生物、藻类、演替规律等单元及相互作用关系构成的生态体系，涉及到一系列的生态和代谢变化体系，多基因的遗传转化成为耐性生物育种的基础[17]。盐碱地小球藻(Chlorellasp. X1)的独特喜盐碱性的代谢生理特性，必将成为耐盐碱基因挖掘的对象[14]。本研究将CsCyp1A基因转化到拟南芥，对T3代过表达拟南芥的抗NaCl胁迫分析表明，转基因植株的根长和鲜重相对野生型植株生长抑制差异显著，过表达株系的MDA含量低于WT的(图7)，与张安红等研究过表达GhCYP1基因的陆地棉棉花发现，在盐胁迫处理条件下，纯合转基因棉花株系比非转基因对照株长势强，抗过氧化物酶活性生理活性以及叶绿素含量均明显高于对照相同[30]，说明过量表达CsCyp1A基因提高了拟南芥对盐碱逆境的抗性。在植物生长不利的情况下，通过其动态功能来稳定蛋白质结构[31～32]。小球藻是生长在东北松嫩盐碱草甸上特殊的噬碳酸盐的藻类，亲环蛋白参与防御机制可能通过PPIase的活性变化来实现，本研究检测到CsCyp1A蛋白PPIase活性和过表达提高抗盐性作用，将通过对亲环蛋白耐盐碱机制的进一步研究和分子育种，对未来的植物抗盐碱胁迫领域的综合应用具有十分重要的意义。

1.Liu J,Farmer J D Jr,Lane W S,et al.Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes[J].Cell,1991,66(4):807-815.

2.Handschumacher R E,Harding M W,Rice J,et al.Cyclophilin:a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A[J].Science,1984,226(4674):544-547.

3.Fischer G,Wittmann-liebold B,Lang K,et al.Cyclophilin and peptidyl-prolylcis-transisomerase are probably identical proteins[J].Nature,1989,337(6206):476-484.

4.Takahashi N,Hayano T,Suzuki M.Peptidyl-prolylcis-transisomerase is the cyclosporin A-binding protein cyclophilin[J].Nature,1989,337(6206):473-475.

5.罗春,徐灵,何静,等.池蝶蚌CyPA的应激表达及对Hela细胞生长的影响[J].水生生物学报,2015,39(3):475-481.

Luo C,Xu L,He J,et al.The expression of cyclophilin a(CyPA) inHyriopsisschlegeliiin response to pathogens and its effect on the growth of Hela cells[J].Acta Hydrobiologica Sinica,2015,39(3):475-481.

6.Gullerova M,Barta A,Lorkovic Z J.AtCyp59 is a multidomain cyclophilin fromArabidopsisthalianathat interacts with SR proteins and the C-terminal domain of the RNA polymerase II[J].RNA,2006,12(4):631-643.

7.Umezawa T,Okamoto M,Kushiro T,et al.CYP707A3,a major ABA 8′-hydroxylase involved in dehydration and rehydration response inArabidopsisthaliana[J].The Plant Journal,2006,46(2):171-182.

8.Matilla A J,Carrillo-barral N,Del Carmen Rodríguez-Gacio M.An update on the role of NCED and CYP707A ABA metabolism genes in seed dormancy induction and the response to after-ripening and nitrate[J].Journal of Plant Growth Regulation,2015,34(2):274-293.

9.Chen A P,Wang G L,Qu Z L,et al.Ectopic expression ofThCYP1,a stress-responsive cyclophilin gene fromThellungiellahalophila,confers salt tolerance in fission yeast and tobacco cells[J].Plant Cell Reports,2007,26(2):237-245.

10.Kim S K,You Y N,Park J C,et al.The rice thylakoid lumenal cyclophilin OsCYP20-2 confers enhanced environmental stress tolerance in tobacco andArabidopsis[J].Plant Cell Reports,2012,31(2):417-426.

11.Zhu C F,Wang Y X,Li Y B,et al.Overexpression of a cotton cyclophilin gene(GhCyp1) in transgenic tobacco plants confers dual tolerance to salt stress andPseudomonassyringaepv.tabaciinfection[J].Plant Physiology and Biochemistry,2011,49(11):1264-1271.

12.梁凌星.抗咪鲜胺杧果胶孢炭疽菌突变的CYP51基因功能探究[D].福州:福建农林大学,2015.

Liang L X.The functional study of mutated CYP51 inColletotrichumgloeosporioidesfor resistance to prochloraz[D].Fuzhou:Fujian Agriculture Forestry University,2015.

13.Sekhar K,Priyanka B,Reddy V D,et al.Isolation and characterization of a pigeonpea cyclophilin(CcCYP) gene,and its over-expression inArabidopsisconfersmultiple abiotic stress tolerance[J].Plant Cell & Environment,2010,33(8):1324-1338.

14.Qiao K,Takano T,Liu S K.Discovery of two novel highly tolerant NaHCO3trebouxiophytes:identification and characterization of microalgae from extreme saline-alkali soil[J].Algal Research,2015,9:245-253.

15.王旭辉,乔坤,汪振娟,等.小球藻亲环蛋白A(CyPA)基因克隆及表达特性分析[J].植物研究,2014,34(2):245-251.

Wang X H,Qiao K,Wang Z J,et al.Cloning and expression analysis of cyclophilins A(CyPA) gene form chlorella[J].Bulletin of Botanical Research,2014,34(2):245-251.

16.李秀军,李取生,王志春,等.松嫩平原西部盐碱地特点及合理利用研究[J].农业现代化研究,2002,23(5):361-364.

Li X J,Li Q S,Wang Z C,et al.A research on characteristics and rational exploitation of soda saline land in the western Songnen Plain[J].Research of Agricultural Modernization,2002,23(5):361-364.

17.林栖凤,李冠一.植物耐盐性研究进展[J].生物工程进展,2000,20(2):20-25.

Lin Q F,LI G Y.Research progress in salt tolerance in plants[J].Progress in Biotechnology,2000,20(2):20-25.

18.Fischer G,Bang H,Mech C.Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides[J].Biomedica Biochimica Acta,1984,43(10):1101-1111.

19.Clough S J,Bent A F.Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsisthaliana[J].The Plant Journal,1998,16(6):735-743.

20.Hodges D M,Delong J M,Forney C F,et al.Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds[J].Planta,1999,207(4):604-611.

21.冯玉杰,陈桥.盐碱地生态体系构成及研究进展[C].//第八次全国环境微生物学术研讨会论文集.哈尔滨:中国微生物学会,2005.

Feng Y J,CHEN Q.Composition and research progress of Saline-alkali land ecological system[C].//Proceedings of the eighth national conference on environmental microbiology.Harbin:Chinese Society for Microbiology,2005.

22.Ivery M T.Immunophilins:switched on protein binding domains?[J].Medicinal Research Reviews,2000,20(6):452-484.

23.Bauer K,Kretzschmar A K,Cvijic H,et al.Cyclophilins contribute to Stat3 signaling and survival of multiple myeloma cells[J].Oncogene,2009,28(31):2784-2795.

24.Sun S,Wang Q W,Giang A,et al.Knockdown of CyPA inhibits interleukin-8(IL-8) and IL-8-mediated proliferation and tumor growth of glioblastoma cells through down-regulated NF-κB[J].Journal of Neuro-Oncology,2011,101(1):1-14.

25.Fan T J,Han L H,Cong R S,et al.Caspase family proteases and apoptosis[J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2005,37(11):719-727.

26.刘沛,徐兆师,晏月明,等.小麦TaMAPK2激酶基因的原核表达及多克隆抗体制备[J].植物遗传资源学报,2011,12(1):92-95,102.

Liu P,Xu Z S,Yan Y M,et al.Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of the wheatTaMAPK2 gene[J].Journal of Plant Genetic Resources,2011,12(1):92-95,102.

27.王镜岩,朱圣庚,徐长发.生物化学[M].北京:高等教育出版社,2002:164-165.

Wang J Y,Zhu S G,Xu C F.Biochemistry[M].Beijing:Higher Education Press,2002:164-165.

28.He Z Y,Li L G,Luan S.Immunophilins and parvulins.Superfamily of peptidyl prolyl isomerases inArabidopsis[J].Plant Physiology,2004,134(4):1248-1267.

29.Vallon O.Chlamydomonas immunophilins and parvulins:survey and critical assessment of gene models[J].Eukaryotic Cell,2005,4(2):230-241.

30.张安红,王志安,肖娟丽,等.亲环素基因GhCYP1在陆地棉中的过量表达及耐盐性分析[J].山西农业科学,2014,42(2):107-109,122.

Zhang A H,Wang Z A,Xiao J L,et al.Overexpression of cyclophilin gene(GhCYP1) in trangentic cotton and its salt tolerance analysis[J].Journal of Shanxi Agricultural Sciences,2014,42(2):107-109,122.

31.Trivedi D K,Bhatt H,Pal R K,et al.Structure of RNA-interacting cyclophilin A-like protein fromPiriformosporaindicathat provides salinity-stress tolerance in plants[J].Scientific Reports,2013,3:3001.

32.Trivedi D K,Ansari M W,Bhavesh N S,et al.Response ofPiCypAtobacco T2 transgenic matured plant to potential tolerance to salinity stress[J].Plant Signaling & Behavior,2014,9(1):e27538.

The National Key Research and Development Program of China(2016YFC0501203)；Heilongjiang province start postdoctoral scientific research grants(LBH-Q15004)；The national youth fund(31500317)

introduction：LIAO Xu(1993—),male,master,major in saline-alkali gene mining and function research.

date:2017-04-17

ProkaryoticExpression,ActivityAssayofChlorellaCyclophilinAandSaltToleranceAnalysisofArabidopsisOver-expressingCsCyp1A

LIAO Xu1HE Ming-Liang1ZHANG Su-Yan2MA Hai-Yan1WANG Xu-Hui1LUO Qiu-Xiang1GUAN Qing-Jie1*

(1.Northeast Forestry University,Alkali Soil Natural Environmental Science Center,Harbin 150040；2.Dehui No.9 Middle School in Jilin Province,Dehui 130300)

In order to test the activity of peptidyl-prolyl cis-trans isomerase of cyclophilin encoded byCsCyp1A, which was isolated fromChlorellasp. X1 in previous research(Accession No:KY207381), the primers were designed by usingpMD18-T-CsCyp1Aplasmid DNA as template and the target gene fragment that includedKpnⅠ andSalⅠ digestion sites were obtained by cloning. After enzyme digestion, ligation and sequence analysis, the His-taggedpQE-30-CsCyp1Aprokaryotic expression vector was obtained. IPTG inducedE.coliM15 strain which contained its plasmid to express the fusion protein. Purified soluble HisCsCypA fusion protein was obtained by purification on a Nitra-column and the relative molecular mass of CsCyp1A was about 29 kDa. HisCsCyp1A protein hybridization signal was detected by Western blot. By enzyme activity analysis, the production rate of chromogenic groups in HisCsCyp1A fusion protein was significantly faster than in control, and the CsCyp1A protein could catalyze the cis-trans folding of Xaa-Pro peptide bond in N-succinyl-Xaa-Pro- Phe-p-nitroanilide and accelerate the cleavage of blocking groups. The purified CsCyp1A protein had PPIase activity. By overexpression ofCsCyp1Agene driven by 35S promoter inArabidopsisthalianaunder vacuum infiltration, the results showed that it increased the tolerance of overexpression lines to NaCl stress, and revealed the salt tolerance of ChlorellaCsCyp1Agene. It will become a genetic resource for resistance breeding. The study established the foundation for exploring the biological role of chlorella cyclophilin CsCyp1A in the anti-carbonate stress of algae.

phytococcal chlorella;saline-sodic soil;cyclophilin A;peptide prolyl cis-trans isomerase;prokaryotic expression protein

国家重点研发计划(2016YFC0501203)；黑龙江省博士后科研启动资助金(LBH-Q15004)；国家青年基金(31500317)资助

廖栩(1993—)，男，硕士研究生，主要从事耐盐碱相关基因挖掘与功能研究。

* 通信作者：E-mail:guanqingjie@nefu.edu.cn

2017-04-17

* Corresponding author：E-mail:guanqingjie@nefu.edu.cn

Q812

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.012