稳定表达人α-分泌酶adam10基因启动子荧光素酶报告基因细胞系的构建研究

唐 颖，胡小童，朱炳林，韩 宇

(重庆医科大学附属第一医院神经内科 400016)

稳定表达人α-分泌酶adam10基因启动子荧光素酶报告基因细胞系的构建研究

唐 颖，胡小童，朱炳林，韩 宇△

(重庆医科大学附属第一医院神经内科 400016)

目的构建携带adam10基因启动子的荧光素酶报告载体，筛选稳定表达细胞系并分析其活性。方法提取人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)基因组DNA，以其为模板，PCR扩增adam10基因启动子并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.17中，构建adam10基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.17-adam10，将其转染SH-SY5Y细胞(无启动子的pGL4.17载体作阴性对照，带有CMV启动子的pGL4.51载体作阳性对照)，经G418进行稳定表达株的筛选，用1 μmol/L维甲酸处理细胞4 d后检测其荧光活性。结果成功扩增到438 bp的adam10基因启动子，pGL4.17-adam10经PCR和双酶切鉴定均正确。SH-SY5Y细胞被该载体转染后经G418筛选得到稳定表达adam10基因启动子的细胞株，经检测具有较强的转录活性；1 μmol/L维甲酸能诱导adam10基因启动子高效表达。结论成功构建了人adam10基因启动子荧光素酶报告载体，adam10基因启动子在SH-SY5Y细胞中能稳定表达，为深入研究adam10基因的表达调控、多态性分析及其高通量药物筛选提供基础。

去整合素和金属蛋白酶10；启动子；荧光素酶报告载体；高通量药物筛选

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种神经退行性疾病，近年来其发病率不断增高。现有许多证据支持淀粉样蛋白(amyloid beta，Aβ)沉积是AD主要致病机制之一[1]。Aβ是由β-和γ-分泌酶在异常情况下水解淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)后产生的短肽。正常情况下，α-分泌酶水解APP产生可溶性且具有神经营养和神经保护作用的sAPPα片段，从而防止有毒性的Aβ的产生[2]。研究证实，去整合素和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10)是神经细胞生理相关的组成型APP α-分泌酶[3]，且ADAM10过表达能预防淀粉样病变和提高长时程增强作用及学习记忆功能[4-5]。因此，α-分泌酶ADAM10被作为AD药物潜在靶点。近年来，adam10基因多态性已在许多神经系统疾病中得到研究[6-7]，adam10基因rs653765和rs514049位点的多态性被认为可调节AD患者APP表达[8]。目前，有大量关于ADAM10与其底物相互作用的研究，针对ADAM10分子的靶向治疗有望为治疗AD提供新思路，然而对于ADAM10分子上游调控机制尚不清楚。本实验通过克隆人adam10基因启动子，构建荧光素酶报告系统并筛选稳定细胞株，为进一步研究adam10基因转录调控、多态性分析及其高通量药物筛选提供有力工具。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂 人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)为本实验室保存；Phanta HS高保真DNA聚合酶购自Vazyme公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；pMD19T simple载体购自Takara公司；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、荧光素酶报告质粒pGL4.17与pGL4.51、荧光素酶检测试剂均购自Promega公司；TRIzol、逆转录酶试剂盒、脂质体2000购自Invitrogen公司；DMEM/F12培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；维甲酸、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；感受态细胞DH5α购自北京鼎国公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。其余试剂为进口分析纯。

1.2方法

1.2.1人基因组模板的制备 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，采用TRIzol法提取基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2adam10基因启动子的扩增 以基因组DNA为模板，采用 Phanta HS高保真DNA聚合酶以特异性引物扩增adam10基因上游约438 bp的启动子区，上游引物：5′-CGG GGT ACC AGC TCT CCG CCG GCG GA C-3′，下游引物5′-CCG CTC GAG TCC TCA CGG GTT AAC AGC AGC ACA T-3′，下划线分别为KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点。PCR反应体系为：10×PCR buffer 3.0 μL，dNTPs 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)，Phanta HS酶0.5 μL，基因组DNA 3.0 μL，加ddH2O补至30 μL。反应条件为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共30个循环；72 ℃延伸7 min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3adam10基因启动子荧光素酶报告载体的构建 PCR产物回收纯化后连接pMD19T simple载体，连接产物转化DH5α感受态，挑取氨苄青霉素筛选的阳性克隆经PCR鉴定，鉴定正确的送测序并命名为pMD19T-adam10。以KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pMD19T-adam10和pGL4.17质粒，割胶回收后经T4 DNA连接酶连接pGL4.17和adam10基因启动子片段。连接产物转化DH5α，挑取阳性克隆后用PCR及KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，PCR和双酶切鉴定均正确的命名为pGL4.17-adam10，提取质粒后-20 ℃保存备用。

1.2.4细胞培养及稳定表达株的筛选 SH-SY5Y细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL链霉素的 DMEM/F12培养液中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

将融合度约80%的SH-SY5Y细胞以6×105接种6孔板，待细胞贴壁生长至70%～80%融合度时进行转染。用Opti-MEM培养基分别稀释载体pGL4.17-adam10(每孔5 μg)和脂质体(每孔5 μL)，pGL4.17和pGL4.51分别作阴性、阳性对照，室温孵育5 min，载体和脂质体混合后室温孵育20 min，加入到SH-SY5Y细胞中，37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。转染后48 h采用1 μg/mL G418进行筛选，筛选后第14天时采用有限稀释法克隆化，待单细胞长满后分别转至24、12、6孔板，10 cm培养皿继续扩大培养(此过程需2～3个月)。得到了来自1株单克隆扩大培养的稳定表达细胞株，用化学发光仪检测其荧光活性。选取荧光强度高的进行后续实验并命名为SH-SY5Y/pGL4.17-adam10和SH-SY5Y/pGL4.51细胞，阴性对照命名为SH-SY5Y/pGL4.17。

1.2.5维甲酸对adam10基因启动子转录功能的影响 将SH-SY5Y/pGL4.17-adam10、SH-SY5Y/pGL4.17和SH-SY5Y/pGL4.51细胞以2×104接种96孔板(各5个重复孔)，生长至70%～80%融合度时加1 μmol/L维甲酸连续处理4 d，然后检测其荧光素酶活性。

1.2.6荧光素酶活性测定 荧光素酶活性测定按照荧光素酶活性检测试剂盒说明书(Promega)进行操作。将SH-SY5Y/pGL4.17-adam10、SH-SY5Y/pGL4.17和SH-SY5Y/pGL4.51细胞以2×104接种96孔板(各5个重复孔)，培养24 h后每孔加与培养基等体积的Luciferase Reagent，轻轻混匀。室温裂解10 min后在化学发光仪Glomax 96(Promega)中测量荧光素酶活性。

2 结 果

2.1adam10基因启动子扩增产物的鉴定 提取SH-SY5Y细胞基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增adam10基因上游长度438 bp的核心启动子区，PCR产物经1%琼脂糖电泳可见大小约438 bp条带，与目的片段大小相合(图1)。PCR产物与克隆载体pMD19T simple连接构建pMD19T-adam10，测序显示所克隆序列无突变。

M:分子量标准;1:adam10基因启动子样品
图1adam10基因启动子PCR扩增

2.2荧光素酶报告载体pGL4.17-adam10的构建与鉴定 克隆载体pMD19T-adam10与携带萤火虫荧光素酶基因的pGL4.17分别以KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，回收438 bp的adam10基因启动子片段与pGL4.17载体连接，转化DH5α后菌液PCR结果表明筛选到阳性克隆。另外，pGL4.17-adam10经KpnⅠ和XhoⅠ酶切后可见大小约5 600 bp(pGL4.17)与438 bp(adam10基因启动子)的两个片段出现。成功构建携带adam10基因启动子的荧光素酶报告载体。见图2。

2.3构建稳定表达adam10基因启动子的细胞系 在6孔板中采用pGL4.17-adam10、pGL4.17或pGL4.51对SH-SY5Y细胞进行转染，48 h后在培养基中加入G418进行稳定筛选，14 d后挑取单克隆转入细胞培养瓶中进行克隆扩大培养，获得稳定表达株SH-SY5Y/pGL4.17-adam10、SH-SY5Y/pGL4.17和SH-SY5Y/pGL4.51。

2.4稳定表达株具有启动活性 荧光素酶活性检测分析表明，阴性对照SH-SY5Y/pGL4.17的荧光活性仅有4 007.0±95.4，而SH-SY5Y/pGL4.17-adam10和SH-SY5Y/pGL4.51均具有较强的荧光活性，分别是阴性对照组的(369.0±51.6)倍和(697.7±71.2)倍，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

A:pGL4.17-adam10载体的PCR鉴定，泳道1～3为1～3号样品；B:pGL4.17-adam10载体的双酶切鉴定，M为DNA marker，泳道1为adam10基因启动子样品1
图2荧光素酶报告载体pGL4.17-adam10的鉴定

2.5维甲酸对adam10基因启动子的影响 稳定表达的3种细胞系经1 μmol/L维甲酸处理4 d后，测定其荧光素酶活性。结果表明，相比DMSO处理组，维甲酸处理后SH-SY5Y/pGL4.17-adam10的荧光活性明显升高(P=0.029)，但并没有影响CMV启动子的活性。见图4。

3 讨 论

目前对AD治疗的研究均致力于开发β-和γ-分泌酶抑制剂，以抑制Aβ的产生[9-10]。但这两种分泌酶除参与APP剪切外，还能剪切多种蛋白分子，比如黏附分子cadherin和Notch等，所以非特异性地抑制β-和γ-分泌酶会导致生理功能紊乱[11-15]。相反，提高α-分泌酶比如ADAM10的活性既能防止Aβ的形成，而且产生的sAPPα又具有神经营养和保护作用。研究显示，adam10转基因小鼠与AD模型小鼠杂交后，其病理性斑块显著降低，可溶性sAPPα片段明显升高，小鼠的学习记忆能力有所提高；相反adam10基因突变小鼠脑内sAPPα含量降低，病理性斑块增加[4]。因此，ADAM10的靶向治疗可能成为治疗AD的一种新途径[14-15]。因此，构建携带人adam10基因的荧光素酶报告载体来研究adam10基因的调控和功能具有重要意义。

本实验通过克隆人adam10基因启动子区域，构建荧光素酶报告载体pGL4.17-adam10，并成功筛选到稳定表达该启动子的SH-SY5Y细胞系。SH-SY5Y/pGL4.17-adam10细胞具有较强的转录活性，启动下游荧光素酶的表达，而不含启动子的空白质粒(pGL4.17)转染后几乎没有转录活性。维甲酸能诱导adam10基因启动子高效表达。

综上所述，本实验成功构建了人adam10启动子驱动的荧光素酶报告载体，并建立了稳定表达细胞株，既可用于研究adam10基因的表达调控，也可用于多态性分析及其高通量药物筛选，为将来筛选有效的AD药物奠定基础。

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ConstructionofSH-SY5Ycelllinestablyexpressinghumanα-secretaseadam10genepromoterluciferasereportergene

TangYing,HuXiaotong,ZhuBinglin,HanYu△

(DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo construct the luciferase report vector carrying a disintegrin and metalloprotease 10(adam10) gene promoter,to screen its stable expression cell line and to analyze its activity.MethodsThe genome DNA of human neuroblastoma SH-SY5Y cells was extracted as the template.Theadam10 gene promoter was amplified by PCR and was cloned into luciferase reporter vector pGL4.17.Theadam10 gene promoter luciferase reporter vector pGL4.17-adam10 was constructed and transfected in to SH-SY5Y cells(pGL4.17 vector without promotoer as the negative control and pGL4.17 vector with CMV promoter as the positive control).Then the stable expression cell line was screened by G418 and its fluorescence activity was detect after treating with 1 μmol/L retinoic acid(RA) for 4 d.ResultsAbout 438 bpadam10 gene promoter was successfully amplified by PCR.The pGL4.17-adam10 vector was correct by PCR and double enzyme digestion identification.The cell line stably expressingadam10 gene promoter was obtained after transfecting SH-SY5Y cells by this vector and screening by G418,which had stronger transcriptional activity by detection;1 μmol/L RA could induce high efficiency expression ofadam10 gene promoter.ConclusionHumanadam10 gene promoter luciferase vector is successfully constructed.adam10 gene promoter can be stably expressed in SH-SY5Y cells,which provides a basis for deeply studyingadam10 gene expression regulation,polymorphism analysis and high-throughput drug screening.

a disintegrin and metalloprotease 10;promoter;luciferase reporter vector;high-throughput drug screening

唐颖(1992-)，在读硕士，主要从事阿尔茨海默病发病机制研究。△

，E-mail:hany96@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.020

Q291

A

1671-8348(2017)28-3947-03

2017-04-16

2017-05-22)