趋化因子Fractalkine通过调控IL-6/STAT3信号通路对人胰腺癌细胞株增殖和侵袭的影响研究*

李海洋，黄李雅，吴 阳，刘 慧

(1.宁夏医科大学，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院消化内科，银川 750004；3.陕西中医药大学第二附属医院消化内科，陕西咸阳 712000)

·论著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.002

趋化因子Fractalkine通过调控IL-6/STAT3信号通路对人胰腺癌细胞株增殖和侵袭的影响研究*

李海洋1，黄李雅2△，吴 阳3，刘 慧1

(1.宁夏医科大学，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院消化内科，银川 750004；3.陕西中医药大学第二附属医院消化内科，陕西咸阳 712000)

目的探讨趋化因子Fractalkine(FKN)通过调控白细胞介素(IL)-6/信号传导与转录激活因子(STAT)3信号通路对人胰腺癌细胞株PANC-1和SW-1990增殖、侵袭的影响。方法以腺病毒为载体构建、合成FKN-小干扰RNA(siRNA)并转染PANC-1和SW-1990。应用CCK-8法和Transwell检测细胞增殖和侵袭力，蛋白质印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测FKN、IL-6和STAT3蛋白及mRNA的表达。结果转染FKN-siRNA 24 h时，PANC-1及SW-1990各组细胞吸光度值(A值)无明显变化，在48 h和72 h时，FKN-siRNA组A值明显高于对照组和FKN-siRNA阴性组(P<0.05)。转染FKN-siRNA后，PANC-1及SW-1990 FKN-siRNA组细胞侵袭力明显强于对照组和FKN-siRNA阴性组(P<0.05)。PANC-1及SW-1990转染FKN-siRNA后，与对照组和FKN-siRNA阴性组相比较，FKN-siRNA组细胞FKN蛋白和mRNA的表达明显减少(P<0.05),IL-6与STAT3蛋白和mRNA的表达明显增加(P<0.05)。结论趋化因子FKN可能通过IL-6/STAT3信号通路对胰腺癌细胞生物学活性发挥了抑制作用。

趋化因子Fractalkine；转染；胰腺癌细胞株；白细胞介素6；STAT3

胰腺癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率在全球范围内呈上升趋势。在我国，近10年胰腺癌的发病率居恶性肿瘤的第6位，胰腺癌患者的中位生存时间为3～5个月，1年生存率小于10%[1]，其严重危害着人民的身体健康。目前胰腺癌的早期诊断及有效治疗还是尚待解决的问题。趋化因子Fractalkine(FKN)是CX3C家族中的唯一成员，在肿瘤的发生、发展过程中起着一定的作用，如介导癌细胞黏附、浸润及转移，促进肿瘤血管生成等，由于其具有特殊的白细胞趋化及分子黏附作用，FKN在各肿瘤中发挥着不同的作用，即抑制肿瘤生长和促进肿瘤生长。白细胞介素-6(IL-6)是一种多效能细胞因子，其结合可溶性IL-6受体 (soluble interleukin-6 receptor，sIL-6R) 形成IL-6/sIL-6R复合物，继而活化细胞膜表面的gpl30，诱导信号传导与转录激活因子(STAT)3活化[2]，IL-6/STAT3信号通路与肿瘤的发生、发展也有着密切的联系。本实验拟通过以腺病毒为载体，包装构建FKN-小干扰RNA(siRNA)并沉默FKN在人胰腺癌细胞株PANC-1及SW1990中的表达，探讨FKN对人胰腺癌细胞株生物学特性的影响和IL-6/STAT3信号通路在人胰腺癌细胞株中的作用变化，寻求临床治疗胰腺癌新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1主要试剂 FKN、STAT3、IL-6和辣根过氧化物酶标记的二抗等抗体(美国abcam公司)，内参GAPDH(北京中杉金桥生物公司)；CCK-8(美国Sigma公司)，Transwell小室(美国Millipore Carrlgtwahill公司)，Matrigel胶(美国B&D公司)；TRIzoI和反转录试剂盒(美国Thermo Fisher scientific公司)；RT-qPCR试剂盒(美国KAPA Biosystems公司)。

1.1.2细胞株、腺病毒载体 人胰腺癌细胞株PANC-1及SW1990(上海北纳创联生物技术有限公司)在宁夏医科大学总医院外科实验室传代培养。上海生工生物工程有限公司设计、构建、合成、鉴定、测序并扩增以腺病毒为载体的FKN-siRNA。

1.2方法

1.2.1细胞转染 将人胰腺癌细胞株PANC-1及SW1990使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞按每孔1×105接种于6孔板中，加入完全培养基置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞融合度达到70%以上时，加入腺病毒包装的FKN-siRNA(10 mmol/L)对细胞进行转染，转染适当时间后继续后续的实验。

1.2.2CCK-8法检测细胞增殖活性 取对数生长期细胞按每孔1×105接种于96孔板中(每孔100 μL)，将培养板置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养12 h。设置对照组、FKN-siRNA组及FKN-siRNA阴性组，每组均设3个复孔，分别在24、48、72 h时向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，将培养板放入培养箱内孵育2 h,用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度值(A值)。

1.2.3细胞侵袭实验 将Transwell小室置于24孔板中，在小室内膜上加入1∶8稀释的Matrigel胶(每孔60 μL)，放置于培养箱4～5 h。设置对照组、FKN-siRNA组及FKN-siRNA阴性组，每组均设3个复孔，并向各Transwell小室中加入细胞悬液每孔100 μL(每孔1×105)，向24板下室中加入600 μL含胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中常规培养24 h。取出Transwell小室，弃去孔中培养基，用棉签轻轻擦去膜上层的细胞，结晶紫染色，在高倍显微镜下随机观察5个视野细胞，计数。

1.2.4蛋白质印迹法(Western blot)检测FKN、IL-6和STAT3蛋白的表达 提取人胰腺癌细胞株总蛋白，并采用BCA法检测蛋白浓度，加入蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，100 V恒定电压转膜110 min，将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭90 min后，分别加入FKN、IL-6和STAT3一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)，室温摇床孵育90 min，SuperSignal West Pico化学发光底物发光，使用Image Quant LAS 4000进行曝光，采用Image J软件对FKN、IL-6、STAT3和内参GAPDH蛋白条带进行分析，以内参GAPDH与FKN、IL-6和STAT3分别相比较的值作为其蛋白相对表达量。

1.2.5实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测FKN、IL-6和STAT3 mRNA的表达 应用TRIzol提取细胞总RNA后，反转录成cDNA。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。FKN：上游引物5′-CTG CCC TGA CTA GAA ATG GT-3′，下游引物5′-CAG TCG GTT CCA AAG TAA GG-3′，141 bp；IL-6：上游引物5′-TGC CTT CTT GGG ACT GAT-3′，下游引物5′-CTG GCT TTG TCT TTC TTG TTA-3′，384 bp；STAT3：上游引物5′-GAT GCT GGA GGA GAG AAT CG-3′，下游引物5′-TGT GTT TGT GCC CAG AAT GT-3′，265 bp；GAPDH：上游引物5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，460 bp。根据KAPA SYBR FAST qPCR试剂盒要求加入各反应体系量，采用CFX ConnetTM荧光定量PCR仪进行扩增定量，FKN、IL-6和STAT3 mRNA的相对表达量通过2-△△CT法计算得到，结果采用倍数表示。

2 结 果

2.1FKN-siRNA转染后对人胰腺癌细胞株PANC-1及SW-1990增殖的影响 通过CCK-8法检测细胞的增殖活性显示：PANC-1及SW-1990转染FKN-siRNA 24 h时，各组细胞A值无明显变化，在48 h和72 h时，FKN-siRNA组A值明显高于对照组和FKN-siRNA阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

图1 PANC-1不同时点各组的吸光度曲线

图2 SW-1990不同时点各组的吸光度曲线

2.2FKN-siRNA转染后对人胰腺癌细胞株PANC-1及SW-1990侵袭的影响 PANC-1及SW-1990转染FKN-siRNA后， FKN-siRNA组细胞侵袭力明显强于对照组和FKN-siRNA阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 PANC-1及SW-1990各组穿膜细胞数比较

2.3Western blot检测FKN、IL-6和STAT3蛋白的表达 PANC-1及SW-1990转染FKN-siRNA后，与对照组和FKN-siRNA阴性组相比较，FKN-siRNA组细胞FKN蛋白的表达明显减少(P<0.05),IL-6与STAT3蛋白的表达明显增加(P<0.05)。见图3、4。

图3 PANC-1中FKN、IL-6及STAT3蛋白的表达

图4 SW-1990中FKN、IL-6及STAT3蛋白的表达

2.4RT-qPCR法检测FKN、IL-6和STAT3 mRNA的表达 PANC-1转染FKN-siRNA后显示:对照组细胞FKN mRNA的表达是FKN-siRNA组1.74倍，FKN-siRNA阴性组细胞FKN mRNA是FKN-siRNA组的1.83倍，FKN-siRNA组细胞中FKN mRNA的表达明显下降(P<0.05)；FKN-siRNA组细胞IL-6和STAT3 mRNA的表达分别是对照组的2.03倍和1.79倍，FKN-siRNA阴性组的1.95倍和1.81倍，FKN-siRNA组细胞IL-6和STAT3 mRNA的表达明显升高(P<0.05)。SW-1990转染FKN-siRNA后显示：对照组细胞FKN mRNA的表达是FKN-siRNA组1.81倍，FKN-siRNA阴性组细胞FKN mRNA的表达是FKN-siRNA组的1.77倍，FKN-siRNA组细胞FKN mRNA表达明显下降(P<0.05)；FKN-siRNA组细胞IL-6和STAT3 mRNA的表达分别是对照组的1.76倍和1.80倍，FKN-siRNA阴性组的1.71倍和1.79倍，FKN-siRNA组细胞IL-6和STAT3 mRNA的表达明显升高(P<0.05) 。

3 讨 论

趋化因子FKN是CX3C亚家族中的唯一成员，与其他趋化因子区别在于它是一种跨膜糖蛋白，其具有独特的趋化和黏附双重作用。多项研究表明，FKN在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用。一方面，FKN可以介导肿瘤细胞与内皮细胞的黏附、侵袭和转移，诱导肿瘤血管的形成从而促进肿瘤生长[2-3]。另一方面，FKN又可以趋化NK细胞、CD8+T细胞及CD4+T细胞等免疫细胞到肿瘤的局部，减少侵袭及转移的发生，进而抑制肿瘤的发生[4]。FKN在胰腺癌中发挥着何种作用，这需要进一步探讨研究。

本实验研究发现，通过对人胰腺癌细胞株PANC-1和SW1990转染FKN-siRNA后，细胞侵袭力明显增强，反映出FKN可能在胰腺癌细胞株中发挥着抑制作用，这种假设是否成立，并且趋化因子FKN是否还在其他消化系统肿瘤中起到类似的抑制作用。Jones等[5]研究发现，将FKN导入到小鼠肝癌细胞中，然后种植在小鼠体内，可以增强抗肿瘤免疫，从而抑制肝癌的生长；Tang等[6]发现高表达FKN的结直肠癌患者预后要好于低表达FKN的患者。以上研究初步证实趋化因子FKN在消化系统肿瘤中能够抑制肿瘤的发生、发展，这与本实验结果相一致。 Ohta等[7]研究显示，通过结合肿瘤细胞表面的膜型FKN后可以激活NK细胞，从而发挥抗肿瘤作用，进一步证明了FKN具有抑制肿瘤发生、发展的作用。

笔者研究发现，IL-6/STAT3信号通路在多种肿瘤中起着非常重要的作用。有研究表明，结直肠癌患者的血清和癌组织中IL-6的水平均升高，且与肿瘤大小、肿瘤转移、预后和生存率相关[8-10]，并且90%以上的结直肠癌细胞发生STAT3的持续活化，其加强了肿瘤细胞的增殖和肿瘤的生长[11]。在宫颈鳞状细胞癌中亦发现了STAT3的持续激活[12]。IL-6/STAT3信号通路作为重要的炎症信号转导途径之一，已证明IL-6/STAT3信号通路在胰腺癌的发生、发展过程中起着重要的诱导、促进作用[13-14]。本实验显示：与对照组和FKN-siRNA阴性组相比较，FKN-siRNA组细胞FKN的蛋白及mRNA的表达减少，IL-6、STAT3的蛋白及mRNA的表达增加；细胞侵袭试验证实FKN-siRNA组细胞侵袭力较对照组与FKN-siRNA阴性组强。这都初步阐明FKN在胰腺癌中抑制肿瘤的发生、发展，IL-6/STAT3信号通路在胰腺癌的发生、发展中起着重要的作用。黄陈等[15]研究显示，通过AG490可以抑制胰腺癌中SATA3的活化，从而降低肿瘤细胞的增殖和侵袭力，促进细胞凋亡。本实验发现，随着趋化因子FKN表达的下调，IL-6/STAT3表达明显升高，说明趋化因子FKN与STAT3信号通路之间存在着一定的相关性，在一定程度上认为FKN是通过IL-6/STAT3信号通路对胰腺癌的增殖和侵袭产生影响。

本研究初步探讨了FKN对胰腺癌增殖和侵袭的影响及与IL-6/STAT3信号通路之间的关系，结果显示FKN对胰腺癌细胞生物学活性起着抑制作用，并且通过IL-6/STAT3信号通路对胰腺癌的增殖和侵袭产生影响。这揭示着通过阻断趋化因子FKN及IL-6/STAT3信号通路可能为胰腺癌的临床治疗提供新的理论依据和治疗策略。

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EffectsofchemokineFractalkineonproliferationandinvasionofhumanpancreaticcancercelllinesbyregulatingIL-6/STAT3signalpathway*

LiHaiyang1,HuangLiya2△,WuYang3,LiuHui1

(1.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;2.DepartmentofGastroenterology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;3.DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,ShaanxiTraditionalChineseMedicineUniversity,Xianyang,Shaanxi712000,China)

ObjectiveTo explore the effects of chemokine Fractalkine(FKN) on the proliferation and invasion of human pancreatic cancer cell lines PANC-1 and SW-1990 by regulating IL-6/STAT3 signal pathway.MethodsAdenovirus served as the vector to construct and synthesizing FKN-small interfering RNA(siRNA),then which was transfected into PANC-1 and SW-1990.The proliferation and invasion ability of cells was determined by CCK-8 assay and Transwell assay.Expression of FKN,IL-6 and STAT3 protein and mRNA was detected by Western blot and RT-qPCR.ResultsAfter transfecting FKN-siRNA for 24 h,the absorbance values(A value) in the PANC-1 and SW-1990 groups had no significant changes,the A value at 48,72 h in the FKN-siRNA group was significantly higher than that in the control group and FKN-siRNA negative group (P<0.05).After transfecting FKN-siRNA,the cellular invasive ability in the PANC-1 and SW-1990 FKN-siRNA group was significantly stronger than that in the control group and FKN-siRNA negative group(P<0.05).After transfecting FKN-siRNA in cell lines PANC-1 and SW-1990,compared with the control group and FKN-siRNA negative group,the FKN protein and mRNA expression in the FKN-siRNA group was significantly decreased(P<0.05),while IL-6 and STAT3 protein and mRNA expression was significantly increased(P<0.05).ConclusionChemokine FKN might play the inhibiting effect on the biological activity of pancreatic cancer cells by regulating IL-6/STAT3 signal pathway.

chemokine Fractalkine;transfection;pancreatic cancer cell lines;interleukin-6;STAT3

国家自然科学基金资助项目(81460367)；宁夏自然科学基金资助项目(NZ14118)。

李海洋(1988-)，在读硕士，主要从事胰腺疾病的基础与临床研究。△

，E-mail:txmbw@126.com。

R567

A

1671-8348(2017)28-3893-03

2017-05-18

2017-07-06)