不同生长速度的大黄鱼肠道菌群结构的差异

李英英，陈曦，宋铁英

(福建省农业科学院 生物技术研究所，福建 福州 350003)

不同生长速度的大黄鱼肠道菌群结构的差异

李英英，陈曦，宋铁英

(福建省农业科学院 生物技术研究所，福建 福州 350003)

为分析肠道菌群结构变化对大黄鱼Pseudosciaenacrocea生长速度的影响，采用高通量测序的方法，对生长条件相同、生长速度不同的两组大黄鱼肠道菌群结构进行了研究。结果表明：生长缓慢组鱼肠道内菌群OTUs和菌群多样性指数Chao1显著高于生长正常组(P<0.05)，但两组间Shannon指数差异不显著(P>0.05)；变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、梭杆菌门Fusobacteria和拟杆菌门Bacteroidetes为大黄鱼肠道内的优势菌群，其中变形菌门在两组鱼肠道内的相对丰度超过50%；两组大黄鱼肠道菌群结构变化主要集中在变形菌门、放线菌门Actinobacteria和蓝细菌门Cyanobacteria；科水平上的细菌相对丰度比较结果显示，变形菌门内的鞘脂单胞菌科Sphingomonadaceae、柄杆菌科Caulobacteraceae、丛毛单胞菌科Comamonadaceae、假单胞菌科Pseudomonadaceae和莫拉氏菌科Moraxellaceae在两组鱼肠道内的相对丰度差异显著(P<0.05)，其中莫拉氏菌科在生长缓慢组鱼肠道内的含量显著高于生长正常组(P<0.05)。研究表明，不同生长速度的大黄鱼肠道菌群结构存在差异，生长缓慢组鱼肠道内菌群种类多于生长正常组；变形菌门内菌群变化与大黄鱼生长密切相关，莫拉氏菌科在鱼肠道内含量的变化可能是引起大黄鱼生长变慢的主要原因。

大黄鱼；肠道菌群；高通量测序

肠道微生物对机体具有提供屏障、促进营养吸收、增强免疫力等作用[1]，与机体健康密切相关。肠道菌群结构分析是研究肠道微生物的基础，传统方法如平板分离培养、变性梯度凝胶电泳(DGGE)[2-3]、实时荧光定量PCR(qPCR)[4]等，只能检测某些特定的菌群，灵敏度有限，具有较大局限性。近年来，随着高通量测序技术的发展，以16S rDNA基因为靶对象进行高通量测序，可以全面分析肠道的菌群结构，且灵敏度较高[5]，已成为肠道微生态菌群研究的首选方式。

大黄鱼Pseudosciaenacrocea养殖中，常出现同一批鱼苗在饲喂条件、生活环境等相同的情况下，个体差异明显，部分鱼苗生长速度缓慢的现象。笔者在前期的研究中已经证实，该现象可能与大黄鱼的肠道微生物有关[6]。因此，本研究中用高通量测序技术，对相同饲养条件、不同生长速度的两组大黄鱼肠道菌群结构进行深入的测定分析，以了解肠道菌群结构变化与大黄鱼生长速度间的关系，旨在为深入研究大黄鱼的肠道菌群结构，并进一步优化养殖条件等提供数据资料。

1 材料与方法

1.1材料

试验用大黄鱼采自福州市连江县下屿某近海网箱养殖渔场，取生长300 d的大黄鱼30尾，于冰盒内保存带回实验室。所有鱼取自同一网箱，由同一批鱼苗在相同饲养条件下养殖。所用饲料均为冰鲜料。

1.2方法

根据体鱼质量将所取大黄鱼分成两组，生长缓慢组体质量为10～40 g，生长正常组体质量为60～100 g，每组设3个平行。无菌条件下解剖取鱼肠道(包括其内容物)，准确称取肠道200 mg(由于所选大黄鱼单尾鱼的肠道及其内容物质量不足200 mg，因此，本试验中采用混样，每一样品含4尾鱼的肠道)。将合并后的样品在冰上研磨后移至2 mL离心管中，然后按照粪便基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)[天根生化科技(北京)有限公司]说明书提供的方法进行肠道微生物DNA提取。提取到的DNA基因组样品用超微量紫外分光光度计测定其浓度和质量，再用5 g/L的琼脂糖凝胶电泳检查DNA片段是否完整，检验合格的样品由北京诺禾致源生物科技有限公司进行微生物16S扩增子高通量测序，并对测序得到的数据进行生物信息学分析。

1.3数据分析

将测序得到的原始数据，经过拼接、过滤得到有效数据，再按照97%的相似性进行OTU聚类分析，得到每个样品的OTUs，每个OTU代表不同的物种。鱼体肠道内微生物的丰度和多样性用α多样性指数Chao1和Shannon来表示：Chao1指数为微生物丰度的指标之一，在生态学中常用来估算物种总数；Shannon指数常被用来估算样品中微生物多样性，Shannon指数越大，说明物种分布的越均匀，多样性越高。

试验数据用平均值±标准差表示，用SPSS 16.0软件对试验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，若各处理组间差异达到显著性水平，则进行LSD多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1肠道细菌的多样性分析

两组鱼肠道细菌多样性测序数据见表1，生长缓慢组鱼肠道内的OTU数目、Chao1指数均显著高于生长正常组(P<0.05)，说明生长缓慢组与正常组相比，肠道内菌群种类较多，丰度指数较高。两组的Shannon指数无显著性差异(P>0.05)，说明两组间肠道菌落分布多样性差异不明显。

表1 肠道细菌的多样性指数Tab.1 Diversity indices of bacterial community in the gut

注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同
Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2门分类水平下肠道菌群结构分析

经过测序和比较，结果显示，两组鱼肠道内丰度较高(相对丰度≥0.5%)的8类菌门分别为变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、梭杆菌门Fusobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、栖热菌门Thermi、酸杆菌门Acidobacteria、放线菌门Actinobacteria和蓝细菌门Cyanobacteria，其相对丰度如表2所示。其中，变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门含量远高于其他菌门，为大黄鱼肠道内优势菌门；变形菌门在生长正常组鱼肠道内的含量高于缓慢组，而厚壁菌门、梭杆菌门、拟杆菌门在正常组鱼肠道内的含量低于缓慢组，但两组间均无显著性差异(P>0.05)；两组间放线菌门和蓝细菌门有显著性差异(P<0.05)。

表2 门分类水平下不同生长速度的两组大黄鱼肠道菌群相对丰度Tab.2 Relative abundance of bacterial communities at phylum level in the gut of large yellow croaker Pseudosciaena cracea in two groups with different growth rates %

2.3科分类水平下肠道菌群结构分析

在科水平下对两组鱼肠道菌群结构进行分析，在已明确的195个科中，丰度较高的科共有13个(≥1%)，差异性分析结果显示，有5个科在两组鱼肠道内的相对丰度有显著性差异(P<0.05)，它们在两组鱼肠道内的相对丰度如表3所示。其中，鞘脂单胞菌科Sphingomonadaceae、柄杆菌科Caulobacteraceae、丛毛单胞菌科Comamonadaceae、假单胞菌科Pseudomonadaceae在生长正常组肠道内的含量高于缓慢组，只有莫拉氏菌科Moraxellaceae在生长缓慢组肠道内的含量高于正常组。

表3 科分类水平下不同生长速度的两组大黄鱼肠道菌群相对丰度Tab.3 Relative abundance of bacterial communities at family level in the gut of large yellow croaker Pseudosciaena cracea in the two groups with different growth rates %

3 讨论

3.1不同生长速度的两组大黄鱼肠道菌群丰度和多样性比较

正常动物肠道内均分布有大量微生物菌群，经过长期演化，这些肠道菌群与机体的健康及营养吸收联系及其密切[7]。肠道菌群受宿主膳食、基因型、年龄、疾病、益生菌、药物和生活环境等多种因素影响[8]，是一个动态的平衡。按照与宿主的关系，可将动物肠道内的菌群分为3类：益生菌、致病菌和机会致病菌，一般情况下，机会致病数量最多，益生菌次之，致病菌最少[9]。当机体遭受强烈应激，或者长时间大剂量使用抗生素、糖皮质激素或免疫抑制剂等，均会使肠黏膜受损，肠道的屏障功能和免疫功能作用下降，此时肠道内的致病菌和机会致病菌会趁机大量增殖，造成肠道菌群失调[10]。本研究中采用高通量测序的方法，分析了同等生活条件下生长速度差异明显的两组鱼肠道菌群结构，结果显示，生长缓慢组鱼肠道内菌群OTUs和多样性指数Chao1显著高于正常组，说明生长缓慢组鱼肠道内菌群种类多于生长正常组。作者在前期研究中[6]发现，生长缓慢组鱼肠黏膜损伤严重，肠道内弧菌和酵母菌数量高于生长正常组。由此可以认为，生长缓慢组鱼肠道健康状况较差，正常情况下，生长被抑制的菌群趁机过度繁殖，造成生长速度不同的两组鱼肠道菌群多样性方面表现出差异。

3.2门和科水平上不同生长速度的两组大黄鱼肠道菌群结构比较

通过测序分析发现，大黄鱼肠道内主要菌门有变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门，这与文献中记载的其他水生动物，如牙鲆[11]、草鱼、鲫、鳙[12]、栉孔扇贝[13]、海参[14]等肠道内的优势菌门及含量略有差异。造成这种差异的原因可能是由于水生动物肠道菌群结构受水质和饵料等因素影响较大[8]，而不同水生动物生活的水质和饵料均不相同，因此，其肠道内菌群结构差异较大。对两组鱼肠道含量超过0.5%的8种菌门进行组间比较发现，生长正常组鱼肠道内放线菌门和蓝细菌门含量显著高于生长缓慢组(表2)。放线菌门包含的很多菌种可分泌抗生素和酶[15-16]，在动物肠道和海洋微生态系统中均有重要作用，有研究结果表明，放线菌门可作为衡量动物肠道健康的部分依据[17]。蓝细菌是光合化能类原核生物，在自然界中分布广泛，普遍存在于海水[18-19]和淡水[20-21]中，因水产动物肠道内菌群受水体中微生物影响，在海水[12]和淡水动物[22]肠道内都会包含少量的蓝细菌。但是由于这两种菌门所占的比例较小，其变化与大黄鱼生长速度的关联需要进一步深入研究。

变形菌门在两组鱼肠道中的含量均达到一半以上，其含量远超过其他菌门；在科水平对两组鱼肠道菌群进行比较的结果显示，两组鱼肠道内菌群相对丰度差异显著的5个科都属于变形菌门(表3)，由此可以认为，变形菌门内菌群变化与大黄鱼生长密切相关。变形菌门是细菌中较大的一个门类，广泛分布于土壤[23]、污水[24]、动物[25]、植物[26]和人类体内[27]，既包含了一些无机化能和光合种类，也包含很多病原菌，科研和医学上很多较重要的菌类都属于变形菌门，如肠杆菌科Enterobacteraceae[28]、弧菌科Vibrionaceae[29]和假单胞菌科Pseudomonadaceae[30]等。由于变形菌门内菌群种类繁多，对宿主的作用复杂，因此，要研究变形菌门对大黄鱼鱼体生长的具体影响还需要进一步的研究来证实。

在科水平对两组鱼肠道菌群相对丰度进行差异性比较的结果显示，鞘脂单胞菌科、柄杆菌科、丛毛单胞菌科、假单胞菌科在生长正常组肠道内的含量显著高于生长缓慢组，而莫拉氏菌科在生长缓慢组肠道内的含量显著高于生长正常组。前4科细菌均为海水水体常见菌[31-36]，其对大黄鱼营养吸收及生长的影响目前尚不明确；同时由于大黄鱼肠道进化不完善，长度较短且开放，其肠道菌群结构易受上述海水中微生物的影响[37]，因此，该4科菌在肠道内的变化与大黄鱼生长速度的关系需进一步研究证明。莫拉氏菌[38]常寄存于人和动物器官黏膜上，其科内包含多种致病菌，可引起人或动物疾病。如：黏膜炎莫拉氏菌可导致人的败血症[39]；卡他莫拉氏菌会引起人的下呼吸道感染[40]；兔莫拉氏菌可寄生于牙鲆心脏血液中，可随血液循环至各组织器官，引起牙鲆肝脏、肾脏、脾脏等组织变形，最终导致其死亡[41]。在生长缓慢组鱼肠道内莫拉氏菌科的含量远高于生长正常组，意味着生长缓慢组鱼肠道内健康及免疫状况较差，该结果与作者前期研究结果一致[6]。因此，作者认为，由于生长缓慢组鱼肠道内健康状况较差，正常情况下生长受抑制的致病菌如莫拉氏菌趁机过度繁殖，造成鱼肠道菌群紊乱，消化吸收能力下降，最终导致鱼体生长缓慢。

4 结论

生长速度不同的两组大黄鱼肠道内菌群结构存在差异，生长缓慢组鱼肠道菌群种类多于生长正常组；肠道细菌丰度比较结果显示，变形菌门内菌群变化与大黄鱼生长密切相关，其中，莫拉氏菌科在鱼肠道内含量的变化可能是引起大黄鱼生长变慢的主要原因。

[1] 温俊,孙笑非.水产动物肠道微生态调控研究进展[J].饲料研究,2009(9):68-70.

[2] Stewart C J,Marrs E C L,Magorrian S,et al.The preterm gut microbiota:changes associated with necrotizing enterocolitis and infection[J].Acta Paediatrica,2012,101(11):1121-1127.

[3] Smith B,Bodé S,Skov T H,et al.Investigation of the early intestinal microflora in premature infants with/without necrotizing enterocolitis using two different methods[J].Pediatric Research,2012,71(1):115-120.

[4] 雷毅,王昆华,龚昆梅,等.实时荧光定量PCR在测定艾滋病患者肠道菌群量变化中的应用及意义[J].实用医学杂志,2012,28(1):69-71.

[5] 李东萍,郭明璋,许文涛.16S rRNA测序技术在肠道微生物中的应用研究进展[J].生物技术通报,2015,31(2):71-77.

[6] 李英英,陈曦,李素一,等.肠道消化吸收相关因子对大黄鱼生长速度的影响[J].大连海洋大学学报,2015,30(3):271-275.

[7] 赵庆新,谭远德.鲤科鱼肠道菌分布及共生关系研究[J].中国预防兽医学报,2001,23(2):130-133.

[8] 郑艺,张家超,郭壮,等.基于高通量测序技术分析肠道菌群及其影响因素的研究进展[J].中国食品学报,2014,14(11):157-164.

[9] 尹军霞,林德荣.肠道菌群与疾病[J].生物学通报,2004,39(3):26-28.

[10] 宋增福,吴天星.鱼类肠道正常菌群研究进展[J].水产科学,2007,26(8):471-474.

[11] 李存玉,徐永江,柳学周,等.池塘和工厂化养殖牙鲆肠道菌群结构的比较分析[J].水产学报,2015,39(2):245-255.

[12] 李彤彤.池塘养殖鱼类共附生细菌群落结构的研究[D].北京:中国科学院大学,2015.

[13] 杨彩霞.两个养殖海区及栉孔扇贝消化盲囊细菌群落多样性分析[D].青岛:中国海洋大学,2011.

[14] 窦妍,丁君,王轶南,等.黄、渤海春季刺参肠道及养殖池塘细菌菌群的多样性[J].大连海洋大学学报,2014,29(6):572-576.

[15] Bull A T,Stach J E M,Ward A C,et al.Marine actinobacteria:perspectives,challenges,future directions[J].Antonie van Leeuwenhoek,2005,87(1):65-79.

[16] Cundliffe E.Antibiotic production by actinomycetes:the Janus faces of regulation[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2006,33(7):500-506.

[17] Turnbaugh P J,Hamady M,Yatsunenko T,et al.A core gut microbiome in obese and lean twins[J].Nature,2009,457(7228):480-484.

[18] 窦妍,丁君,曲凌云,等.秋、冬季刺参养殖池塘菌群的多样性分析[J].大连海洋大学学报,2015,30(2):143-148.

[19] 窦妍,赵晓伟,丁君,等.应用高通量测序技术分析北方刺参养殖池塘环境菌群结构[J].海洋与湖沼,2016,47(1):122-129.

[20] 姚延丹,李谷,陶玲,等.复合池塘循环水养殖系统微生物群落结构分析[J].中国水产科学,2011,18(2):407-415.

[21] 范立民,陈家长,吴伟,等.水葫芦栽培对池塘浮游细菌群落结构影响初探[J].上海海洋大学学报,2015,24(4):513-522.

[22] 祭仲石.三种不同环境中鲢鳙肠道微生物研究[D].上海:上海海洋大学,2014.

[23] 刘卢生,玉永雄,郭蕾,等.苜蓿根瘤菌对不同形态磷利用效率的研究[J].草业学报,2015,24(7):60-67.

[24] 白雪,张荣兵,顾剑,等.大型污水处理厂污泥膨胀原因分析及其控制方法[J].中国给水排水,2011,27(23):31-35.

[25] 宋春华,周丽,战文斌,等.一种新的牙鲆病原菌——兔莫拉氏菌[J].海洋学报,2001,23(4):135-140.

[26] 钱科卿,王苏建.栖稻黄色单胞菌感染的临床表现和细胞免疫功能的报道[J].中华医院感染学杂志,2001,11(1):40-42.

[27] 严辉.引起呼吸道感染的卡他莫拉氏菌的检出及药敏试验[J].实用预防医学,2007,14(4):1235-1237.

[28] 田磊,陈中举,孙自镛,等.2005-2014年CHINET肠杆菌属细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2016,16(3):275-283.

[29] 陈盛峰,陈佳,禤金彩,等.北海近岸养殖海域3种弧菌的分离鉴定及耐药性分析[J].动物医学进展,2016,37(6):29-34.

[30] 胡子毅.利用噬菌体控制原料乳中假单胞菌的研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2013.

[31] 张静.菲降解生物膜与河水生物膜中的功能菌群分析[D].杭州:浙江大学,2013.

[32] 于洋.分散剂及生物柴油对石油降解微生物多样性的影响研究[D].青岛:青岛理工大学,2014.

[33] 赵燕,薛林贵,李琳,等.丛毛单胞菌在环境污染物降解方面的研究进展[J].微生物学通报,2012,39(10):1471-1478.

[34] 陈跃辉.细菌Novosphingobiumsp. B-7和Comamonassp. B-9降解木质素及其降解基因研究[D].长沙:中南大学,2013.

[35] 李晓龙,李秋芬,姜娓娓,等.刺参养殖池环境细菌群落对底质改良剂的响应[J].渔业科学进展,2015,36(1):111-118.

[36] 有小娟.象山港养殖区生境修复的沉积环境细菌群落与环境影响因子的研究[D].青岛:中国海洋大学,2013.

[37] 杨彬彬,邵庆均.鱼类肠道微生物的研究进展[J].中国饲料,2013(23):1-4,8.

[38] 邱明庆,钟文蓬,赵林,等.莫拉氏菌感染及分类学研究[J].江西医药,1985,33(3):48-54.

[39] 李以贵,周佑林,郝家明,等.粘膜炎莫拉氏菌致败血症一例[J].海南医学,2000,11(2):87.

[40] 周海良,田玲,刘中华,等.卡他莫拉菌致下呼吸道感染162例耐药分析[J].医学临床研究,2001,21(4):428-429.

[41] 周丽,战文斌,宋微波,等.牙鲆体表溃烂综合症病理组织观察[J].青岛海洋大学学报,2000,30(4):593-597.

DifferencesinintestinalfloraofculturedlargeyellowcroakerPseudosciaenacroceawithdifferentgrowthrates

LI Ying-ying, CHEN Xi, SONG Tie-ying

(Institute of Biotechnology, Fujian Academy of Agricultural Science, Fuzhou 350003, China)

The intestinal microbiota was analyzed in large yellow croakerPseudosciaenacroceacultured in the same conditions with different growth by the high-throughput sequencing to investigate the relationship between growth rate and intestinal flora. The results showed that there were significantly higher quantities of OTUs and Chao1 in the smaller-sized group than those in the larger-sized group (P<0.05), without significant differences in the quantities of Shannon between the two groups (P>0.05). The dominance of Proteobacteria, Firmicutes, Fusobacteria and Bacteroidete was shown in the microbiota, especially Proteobacteria with more than 50% abundances in both groups. The relative abundance in family level revealed that there were significant differences in Sphingomonadaceae, Caulobacteraceae, Comamonadaceae, Pseudomonadaceae and Moraxellaceae between the two groups (P< 0.05), significantly higher relative abundance of Moraxellaceae in the smaller-sized group than that in the larger-sized one. The finding demonstrated that there were differences in intestinal flora in the fish with different growth rates. There was more species in intestinal bacteria in the smaller-sized group than that in the larger-sized group. The growth of the fish seems to be involved in changes in flora of Proteobacteria, and growth differences of the fish are suggested to be attributed to the variation in amount of intestinal Moraxellaceae.

Pseudosciaenacrocea; intestinal flora; high-throughput sequencing

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.05.002

2095-1388(2017)05-0509-05

S965.3

A

2016-12-30

福建省农科院科技创新团队PI项目(2016PI-22)；福建省公益项目(2015R1019-9，2017R1019-2,2017R1019-7)；福建省农科院科技创新项目(PC2017-6)

李英英(1987—)，女，研究实习员。E-mail:liyingying80@126.com

宋铁英(1963—)，女，研究员。E-mail:tieyingsong@163.com