猪乙型脑炎病毒GZ0409-31分离株E基因遗传进化分析

2017-11-08廖洁丹朱梦娇赵明秋陈金顶

中国兽医杂志 2017年9期

廖洁丹，刘薇，朱梦娇 , 赵明秋，陈金顶

(1．佛山科学技术学院生命科学与工程学院 , 广东佛山 528231 ， 2．华南农业大学兽医学院 , 广东广州 510642 ，3．广东永顺生物制药股份有限公司 , 广东广州 511356)

廖洁丹1，2，刘薇2，3，朱梦娇2, 赵明秋2，陈金顶2

本研究采用RT-PCR方法对分离自贵州省发病猪睾丸组织中的流行性乙型脑炎病毒GZ0409-31株的E基因进行克隆和序列测定，利用生物信息学软件对E基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行分子遗传进化关系分析。结果表明，乙型脑炎病毒GZ0409-31毒株与基因Ⅲ型的乙脑病毒毒株属同一分支，遗传进化关系较近。

猪；乙型脑炎病毒；E基因；遗传进化分析

日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)又称流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一种严重威胁人兽健康的中枢神经系统性急性传染病[1-2]。JE具有明显的季节性和一定的地理分布区域，多发生于蚊虫较多的夏秋季节，属于自然疫源性疾病。猪是JEV的重要储存宿主和增殖宿主，是JE的主要传染源。JEV主要引起母猪的繁殖障碍，致死率虽不高，但可引起怀孕母猪流产、死胎或木乃伊胎，也可引起公猪辜丸炎或不育。因此，JE仍是严重危害养猪业的重要疫病之一，给养猪业造成巨大的经济损失[3]。此外，猪群中的JEV经蚊媒传播可导致人群及动物的感染，给公共卫生安全带来极大的威胁。

JEV属于黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)成员。病毒基因组为单股、正链RNA，全长约11 kb，裸露的病毒RNA具有感染性。含有一个开放阅读框(ORF)，编码1个全长为3 432个氨基酸的多聚蛋白前体，成熟切割加工后可形成3个结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白PrM/M和囊膜糖蛋白E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)及两个多肽切割片段[4]。Chen W R和印度学者Uchil分别利用C-PrM、E基因核苷酸序列进行分型显示，到目前为止，JEV在世界范围内存在5个基因型[5- 6]。以往的基因分型显示，同一地区只有一种基因型的分布[7]，而最近几年许多地区出现新的基因型，同一地区的基因型分布越来越混杂。国内有许多学者在乙脑不同的流行区域分离毒株进行分子流行病学研究，以了解目前自然界JEV的流行分布、分子进化、毒力变异等情况。本研究对从贵州省发病猪睾丸组织中分离到的JEV GZ0409-31毒株的E基因进行序列测定，分析该毒株同其他JEV毒株的亲缘关系，从分子水平上研究JE毒株的变异情况。充分了解该毒株的分子进化情况，对JEV的分子流行病学调查、病毒抗原性、病毒基因型、病毒变异及基因工程疫苗的研究具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 毒株背景 2004年从贵州省发病猪的睾丸组织中分离到JEV GZ0409-31分离株，病毒在PK15细胞中传代扩增后置于-80 ℃冰箱中储存。

1.2 病毒RNA提取及RT-PCR鉴定参照TRIZol Reagent试剂说明书抽提JEV GZ0409-31分离株的总RNA。使用M-MLV反转录酶及随机引物将RNA转录为cDNA，反应条件为：42 ℃反转录1 h。以反转获得的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增引物送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

E1：5＇-CGGAATTCACATGTTTAATTGTCTGGGAAT-3＇；

E2：5＇-CGGGATCCATATC AGCATGCACATTGGT-3＇

PCR反应条件为：95 ℃预变性4 min；95 ℃ 变性30 s，59 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1.5 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

1.3 基因克隆及序列测定参照OMEGA公司的DNA凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A®Gel Extraction Kit 50)将PCR产物纯化回收，克隆入pMD18-T载体，选取阳性重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。

1.4 GZ0409-31分离株E基因核苷酸及推导的氨基酸序列分析使用DNAStar软件将JEV GZ0409-31分离株的E基因核苷酸和推导的氨基酸序列与GenBank中不同地区、不同年代分离的各基因型JEV毒株相应序列进行比对，分析它们之间的相似性。

1.5 GZ0409-31分离株E基因进化关系分析从GenBank中选择JE流行的多个国家和地区的各基因型JEV毒株的E基因序列，另选1株墨累河谷脑炎病毒株(MVEV)作为外群，采用NJ(Neighbor Joining)法，以E基因核苷酸序列为基础构建GZ0409-31分离株E基因进化树。

2 结果

2.1 GZ0409-31分离株E基因RT-PCR扩增从病毒液中提取GZ0409-31分离株RNA进行E基因的RT-PCR，扩增产物电泳鉴定结果见图1。由图1可见，E基因扩增出约1 500 bp大小的片段，与预期片段大小相符。

图1 GZ0409-31分离株E基因RT- PCR扩增结果M：DNA Marker DL-5 000； 1：E基因片段； 2：空白对照

2.2 GZ0409-31分离株E基因序列测定与分析将扩增出的E基因片段克隆至pMD18-T载体，进行菌落筛选培养及质粒PCR鉴定，后经上海英骏生物技术有限公司测序，获得其序列数据。应用DNAStar软件对GZ0409-31分离株E基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank的JEV参考毒株序列进行相似性比较分析。结果表明，GZ0409-31分离株E基因与基因 Ⅲ 型参考毒株SA14、JE-84等相应序列的核苷酸相似性在96.2%～99.2%之间；与基因Ⅰ 型参考毒株SC04-27、HN04-11等相应序列的核苷酸相似性在87.9%～88.3%之间；与基因 Ⅱ 型参考毒株JKT5441、FU相应序列的核苷酸相似性分别为88.7%、88.3%；与基因 Ⅳ 型参考毒株JKT9092的核苷酸相似性为86.8%；与基因Ⅴ 型参考毒株Muar相应序列的核苷酸相似性为78.1%。其中，GZ0409-31分离株E基因序列与基因 Ⅲ 型的JE-84株相应序列的核苷酸相似性最高，为99.2%，与基因Ⅴ 型参考毒株Muar的相似性最低，为78.1%。在氨基酸水平上，GZ0409-31分离株E基因推导的氨基酸序列与各参考毒株相应序列的相似性均在90%以上，其中与强毒株SA14的氨基酸相似性高达99.8%，与减毒活疫苗株SA14-14-2株的氨基酸相似性为97.8%。

2.3 GZ0409-31分离株E基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列遗传进化分析选择国内外已发表的JEV不同分离毒株基因型作为参考毒株，同时选l株墨累谷脑炎病毒(MVEV)作为外群，利用DNAStar和MEGA4.0分析软件对GZ0409-31分离株E基因进行遗传进化分析。结果显示，所有毒株在基因进化上分为5大簇，GZ0409-31分离株与归属基因 Ⅲ型的SA14源病毒株(SA14、SA14-14-2)，国内JEV分离株Beijing-1、p3、Ha-3以及国外分离株VN50、Je-84等同处一个大分支，遗传关系较近。根据同源性及进化树上分支的可信度，我们可以判定GZ0409-31分离株属于JEV基因 Ⅲ 型(图2)。

图2 GZ0409-31株E基因遗传进化树

3 讨论

本研究通过对GZ0409-31分离株E基因核苷酸和推导的氨基酸序列与参考毒株序列进行对比分析，发现GZ0409-31分离株E基因与野毒株SA14相应序列存在28个核苷酸、1个氨基酸不一致，与弱毒疫苗株SA14-14-2相应序列存在37个核苷酸、11个氨基酸不一致。有研究表明，JEV强弱毒株间E蛋白氨基酸变化与该病毒毒力相关[8-11]，与减毒关系密切的有E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439等几个位点，其中尤其是E138和E176位点在JEV的减毒过程起了重要作用，这两个位点氨基酸突变可能改变了E蛋自对细胞受体的吸附性，或者引起该病毒对其他细胞不可穿透，这两种机理导致病毒毒力减弱[12-14]。Ni等在对JEV减毒机理进行研究时认为，E138位的谷氨酸(E)替代为赖氨酸(K)后毒力明显的降低[15-16]。本研究结果表明，GZ0409-31分离株与SA14野毒株的E蛋白氨基酸序列几乎一致，只存在一个氨基酸不一致，其毒力关键位点E138和E176也没有发生改变，因此推测两毒株E蛋白在结构、功能及生物学活性上也极为相似；而SA14-14-2弱毒株的E基因在毒力关键位点E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439等都发生改变。由此可见，GZ0409-31分离株与疫苗株相比其毒力较强，亲缘关系更接近SA14野毒株。

JEV遗传进化分析主要以Chen等[5]建立的依据 prM 基因的240个核苷酸和 Paranjpe等[17]依据E基因全序列进行JEV 基因分型。由于prM 基因的240个核苷酸序列较短，分析结果存在一定程度的可变性，而E蛋白基因被认为具有良好的代表性，常用作JEV遗传进化分析的主要方法[18]。Wang等[19]对中国1949-2005年间10个省、市的JEV分离株的研究显示，中国以基因 Ⅲ 型为主，兼有基因Ⅰ型。其中基因Ⅰ型的毒株最早分离来自1977年的云南省，随后河南、广西、辽宁、上海、四川的分离株也存在基因Ⅰ型；基因 Ⅲ 型分离株多来自黑龙江、北京、陕西、贵州、福建；辽宁、云南、上海、四川为基因Ⅰ型和基因 Ⅲ 型共存。另外，相同省份在不同的年份流行株的基因型也有不一致，例如上海在2001、2003、2005年分离到的流行株均为基因Ⅰ型，而2004年主要为基因 Ⅲ 型。2006年河南省南阳市的流行株全部属于基因Ⅰ型，而河南省2004年的流行株也均属于基因Ⅰ型[20]。本研究选择国内外已发表的JEV不同分离株为参考毒株，同时选l株墨累谷脑炎病毒(MVEV)作为外群，利用DNAStar和MEGA4.0分析软件分别以GZ0409-31分离株E基因进行遗传进化分析。结果表明，GZ0409-31分离株与SA14源病毒株(SA14、SA14-14-2等) 基因 Ⅲ型的、国内JEV分离株Beijing-1、p3、Ha-3以及国外分离株VN-50、01VN88等同处一个大分支，遗传关系较近。综上所述，GZ0409-31分离株E基因核苷酸及推导的氨基酸序列与JEV基因 Ⅲ型相应序列相似性最高，由此表明，GZ0409-31分离株属于JEV基因 Ⅲ型。

[1] 梁剑，刘美真，胡培，等. 2009-2015年广东省流行性乙型脑炎流行病学及临床特征分析[J]. 现代预防医学，2016(21): 3 865-3 868.

[2] Mansfield K L, Hernandez-Triana L M, Banyard A C,etal. Japanese encephalitis virus infection, diagnosis and control in domestic animals[J]. Vet Microbiol,2017, 201: 85-92.

[3] 徐微，张桂红，喻正军. 猪乙型脑炎疫苗研究新进展[J]. 猪业科学，2016(05): 98-99.

[4] Lu C Y, Hour M J, Wang C Y,etal. Single-Round Infectious Particle Antiviral Screening Assays for the Japanese Encephalitis Virus[J]. Viruses，2017, 9(4).

[5] Fan J M, Luo J, Chen L,etal. Genetic analysis of strains of Japanese Encephalitis Virus isolated from swine in central China[J]. Virus Genes，2010, 40(3): 357-361.

[6] Chen W R, Tesh R B, Rico-Hesse R. Genetic variation of Japanese encephalitis virus in nature[J]. J Gen Virol，1990, 71 (Pt 12): 2 915-2 922.

[7] Sarkar A, Taraphdar D, Mukhopadhyay B B,etal. Influence of socio-economic status and environmental factors on serologically diagnosed Japanese encephalitis cases in the state of West Bengal, India during 2005-2010[J]. Health, 2012, 4(1):6-12.

[8] Gulati B R, Singha H, Singh B K,etal. Isolation and genetic characterization of Japanese encephalitis virus from equines in India[J]. J Vet Sci，2012, 13(2): 111-118.

[9] 李云云，郭万柱. 流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原表位的原核表达[J]. 黑龙江畜牧兽医，2014(01): 14-16.

[10] 杨会强，倪谦枝，刘杰，等. 乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列稳定性分析[J]. 中国生物制品学杂志，2013(12): 1 701-1 704.

[11] 杨邦玲，王洪强，王凯，等. 乙型脑炎减毒活疫苗毒力稳定性分析[J]. 中国生物制品学杂志，2014(12): 1 512-1 516.

[12] 刘永乐，王艳君，吕英超. 猪乙型脑炎病的诊治[J]. 中国动物保健，2017(04): 35.

[13] Heffelfinger J D, Li X, Batmunkh N,etal. Japanese Encephalitis Surveillance and Immunization - Asia and Western Pacific Regions, 2016[J]. Mmwr Morb Mortal Wkly Rep，2017, 66(22): 579-583.

[14] Gromowski G D, Firestone C Y, Whitehead S S. Genetic Determinants of Japanese Encephalitis Virus Vaccine Strain SA14-14-2 That Govern Attenuation of Virulence in Mice[J]. J Virol，2015, 89(12): 6 328-6 337.

[15] Liu X Y, Yu Y X, Jia L L,etal. Molecular biological characteristics of Japanese encephalitis virus M47strain with low neuroinvasiveness[J]. Chinese Journal of Biologicals，2014, 27 (9): 1 127-1 131.

[16] 唐波，张道华，张雪花，等. 一株猪源乙型脑炎病毒的分离及鉴定[J]. 浙江农业学报,2015(10): 1 698-1 703.

[17] Paranjpe S, Banerjee K. Phylogenetic analysis of the envelope gene of Japanese encephalitis virus[J]. Virus Res，1996, 42(1-2): 107-117.

[18] Chu H, Wu Z, Chen H,etal. Japanese Encephalitis Virus Infection Rate and Detection of Genotype I From Culex tritaeniorhynchus Collected From Jiangsu, China[J]. Vector Borne Zoonotic Dis,2017, 17(7): 503-509.

[19] Wang H Y, Takasaki T, Fu S H,etal. Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China[J]. J Gen Virol,2007, 88(Pt 3): 885-894.

[20] Yuan L, Wu R, Liu H,etal. Tissue tropism and molecular characterization of a Japanese encephalitis virus strain isolated from pigs in southwest China[J]. Virus Res，2016, 215: 55-64.

GeneticEvolutionofEgeneofSwineJapaneseEncephalitisVirusGZ0409-31Strain

LIAO Jie-dan1,2， LIU Wei2,3， ZHU Meng-jiao2， ZHAO Ming-qiu2， CHEN Jin-ding2

(1.College of Life Science and Engineering，FoShan University, Foshan 528231, China;2.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;3. Guangdong Winsun Bio-pharmaceutical co., Itd，Guangzhou 511356, China)

In this study, theEgene ofJapaneseencephalitisvirusGZ0409-31 strain isolated from testicular tissue of Guizhou Province was cloned and sequenced by RT-PCR. The molecular genetic evolution ofEgene nucleotide sequence and deduced amino acid sequence was analyzed by bioinformatics software. The results showed that theJapaneseencephalitisvirusGZ0409-31 strain was the same genotype as the genotype Ⅲ of the Japanese encephalitis virus, and the genetic evolution was similar.

Swine;Encephalitisvirus;Egene; Genetic evolution analysis

CHEN Jin-ding

S855.3

0529-6005(2017)09-0003-04

2017-07-06

国家重点研发计划项目(2017YFD0500600,2017YFD050114);广东省科技计划项目(2015B020230009，2015A050502044)

廖洁丹(1979-)，女，讲师，博士，研究方向为兽医微生物与免疫学，E-mail：liaojiedan@163.com

刘薇(1988-)，女，硕士,研究方向为兽医微生物与免疫学，E-mail:liunei_10000@163.com

注：刘薇与廖洁丹对本文具有同等贡献

陈金顶，E-mail：jdchen@sacu.edu.cn