二甲双胍提高吡柔比星对膀胱癌杀伤活性的研究

陈峰，徐庆康

（武警浙江省总队嘉兴医院，浙江 嘉兴 314000）

·实验研究·

二甲双胍提高吡柔比星对膀胱癌杀伤活性的研究

陈峰，徐庆康

（武警浙江省总队嘉兴医院，浙江 嘉兴 314000）

目的研究二甲双胍对吡柔比星抗膀胱癌活性的改变并探讨其机制。方法CCK-8实验检测吡柔比星和二甲双胍对膀胱癌细胞系T24细胞的杀伤活性；免疫共沉淀及Western blot实验检测二甲双胍及吡柔比星处理后T24细胞中XIAP表达水平及其与caspase-9、caspase-7和caspase-3的相互作用；流式细胞术检测二甲双胍及吡柔比星处理后T24细胞的凋亡情况。结果（1）二甲双胍能显著增强吡柔比星对T24细胞的杀伤活性；（2）二甲双胍抑制T24细胞中XIAP的表达及其与caspase-9、caspase-7和caspase-3的相互作用；（3）二甲双胍显著促进吡柔比星对T24细胞caspase-9、caspase-7和caspase-3的活化和凋亡的诱导；（4）转染XIAP表达质粒后，二甲双胍联合吡柔比星引起的caspases的活化和凋亡的诱导受到明显抑制。结论二甲双胍通过抑制XIAP的表达提高吡柔比星对膀胱癌的杀伤活性。

二甲双胍；XIAP；吡柔比星；膀胱癌

吡柔比星是治疗膀胱癌的常规化疗药物，能诱导肿瘤细胞凋亡，但长期大剂量使用会降低其对肿瘤细胞的敏感性，并引起肉眼血尿、肾毒性等严重的不良反应[1-2]。因此提高膀胱癌细胞对吡柔比星治疗的敏感性有十分重要的意义。本研究目的在于探讨二甲双胍对吡柔比星的协同抗膀胱癌效应及分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂 二甲双胍、吡柔比星和凋亡检测试剂盒购于美国Sigma-Aldrich。CCK-8细胞活力检测试剂盒购于江苏碧云天生物技术有限公司。DMEM培养基购于美国 Gibco公司。XIAP、caspase-9、caspase-7、caspase-3和β-actin抗体购于美国Cell Signaling公司。ECL试剂盒购于美国Pierce公司。pcDNA3.1真核表达质粒和脂质体2000（Lipofectamine 2000）购于美国Invitrogen公司。蛋白G免疫共沉淀琼脂糖珠购于美国Santa Cruz公司。

1.1.2 细胞培养 人膀胱癌细胞系T24购于美国模式菌种保存中心（ATCC）。细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养环境为37°C恒温培养箱中并通入5%CO2。细胞每2～3天传代1次，传代时用胰酶消化液使细胞进入悬浮状态，并用DMEM培养基洗涤2次，将细胞悬液按1:3稀释后传代。

1.2 实验方法

1.2.1 XIAP基因过表达 将XIAP基因的开放阅读框架序列经PCR扩增后，以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接，构建成XIAP重组过表达质粒。将重组的XIAP质粒或对照空质粒 （终浓度为2μg/mL）用Lipofectamine 2000按试剂操作说明书步骤进行包裹后将其加入到无血清培养基进行混合。将贴壁的T24细胞置于该无血清培养基孵育6小时，之后弃去无血清培养基加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24小时。XIAP过表达T24细胞或空质粒转染T24细胞用于后续实验。

1.2.2 相对细胞活力测定 将细胞按5×103/孔接种在96孔板中。实验分组和处理方法如表1。药物处理完毕后，按照CCK-8细胞活力检测试剂盒操作说明书步骤将T24细胞加入10μL CCK-8溶液并在37°C恒温培养箱中孵育2小时。孵育完成后在450nm波长下用酶标仪检测OD值。T24相对细胞活力用以下公式计算：相对细胞活力=OD药物处理组/OD对照组。相对细胞活力越低说明药物对T24细胞的杀伤活性越强。

表1 实验分组和处理方法

1.2.3 免疫共沉淀 将T24细胞按上述分组处理后进行细胞计数，各组取2×106数量的细胞用蛋白提取液提取其中的总蛋白质，等量分成两份，一份在蛋白提取液中加入XIAP抗体孵育过夜，之后加入蛋白G琼脂糖珠孵育2小时。孵育完成后离心收集管底的琼脂糖珠。琼脂糖珠加入Western blot上样缓冲液，沸水浴煮5分钟使蛋白质与糖珠分离，用于Western blot实验。另一份用作免疫共沉淀实验的对照（Input）直接进行Western blot实验，检测caspase-9、caspase-7和caspase-3的总量。

1.2.4 Western blot实验 将T24细胞按上述分组处理后进行细胞计数，取2×106的各组细胞用蛋白提取液提取其中的总蛋白质。将等量的总蛋白质或3.3所得样品用12%SDS-PAGE电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到 PVDF 膜 上 ， 用 XIAP、caspase-9、caspase-7、caspase-3和β-actin抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2小时，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

1.2.5 细胞凋亡实验 T24细胞按上述分组处理后按照凋亡试剂盒说明书步骤，将PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入细胞中孵育20分钟，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，Annexin-V阳性细胞为凋亡细胞。

2 结果

2.1 二甲双胍增强吡柔比星对T24细胞的杀伤活性 对照组和二甲双胍组相对细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05），说明二甲双胍（2μmol/mL）单独处理对T24细胞活力的抑制作用不明显。流式细胞实验结果显示，吡柔比星+二甲双胍组T24的细胞的凋亡率显著高于吡柔比星组和二甲双胍组。实验结果表明，二甲双胍在体外可以显著增强吡柔比星对膀胱癌细胞的杀伤活性和凋亡诱导率。详见表2。

2.2 二甲双胍下调T24细胞中XIAP的表达水平Western blot实验结果显示，二甲双胍能显著降低T24细胞中XIAP的表达水平（图1）。免疫共沉淀实验结果显示，各组T24细胞中caspase-9、caspase-7和 caspase-3的总蛋白量无差别 （图2A），但二甲双胍能显著抑制XIAP与caspase-9、caspase-7和 caspase-3的结合（图2B），表明二甲双胍能显著抑制T24细胞中XIAP的表达，从而减弱XIAP与caspase-9、caspase-7和caspase-3的相互作用。

图1 二甲双胍抑制T-24细胞XIAP蛋白的表达

2.3 二甲双胍通过抑制T24细胞中XIAP的表达增强吡柔比星的凋亡诱导活性 CCK-8实验结果显示，在T24细胞中转染XIAP质粒后，吡柔比星联合二甲双胍对T24细胞的杀伤活性受到明显抑制；流式细胞实验结果则显示，转染XIAP质粒能显著抑制吡柔比星联合二甲双胍对T24细胞凋亡的诱导（表2）。Western blot实验结果显示，二甲双胍能增强吡柔比星对T24细胞caspase-9、caspase-7和caspase-3的活化，但转染XIAP质粒能显著抑制两者联合对T24细胞caspases的活化（图3）。实验结果表明，二甲双胍通过抑制T24细胞中XIAP的表达增强吡柔比星的凋亡诱导活性。

图2 二甲双胍减弱XIAP与caspase-9、caspase-7和caspase-3的相互作用（2A：各组T24细胞中caspase-9、caspase-7和caspase-3的总蛋白量无差异；2B：二甲双胍显著抑制了XIAP与caspase-9、caspase-7和caspase-3的结合）

表2 各组细胞相对细胞活力和凋亡诱导活性（±s）

表2 各组细胞相对细胞活力和凋亡诱导活性（±s）

与对照组比较 *P＜0.05； 与吡柔比星组比较 ＃P＜0.05；与吡柔比星+二甲双胍组比较△P＜0.05

组别 n/孔 相对细胞活力 凋亡诱导率（%）对照组 3 1.0 0±0.0 7 1.7±0.3二甲双胍组 3 0.9 5±0.0 7 2.0±0.3吡柔比星组 3 0.8 4±0.0 6* 7.4±0.6*吡柔比星+二甲双胍组 3 0.4 9±0.0 4# 2 8.7±1.7#吡柔比星+二甲双胍+X I A P质粒组 3 0.7 3±0.0 6△ 1 1.5±0.9△

图3 二甲双胍通过抑制T24细胞中XIAP的表达，增强吡柔比星对 caspase-9、caspase-7和caspase-3的活化。

3 讨论

治疗膀胱癌主要包括肿瘤手术切除和化疗[3]，然而化疗药物的长期大剂量使用会造成肿瘤细胞对其敏感性降低，并引起严重的不良反应，因此提高肿瘤细胞的化疗敏感性非常重要。二甲双胍是一种经典的2型糖尿病治疗药物，然而最近的研究发现，服用二甲双胍可以减少肿瘤的复发率，一些体外实验结果表明，二甲双胍能在一定程度上抑制肿瘤的生长和细胞周期[4-5]。本研究提示，二甲双胍能显著增强吡柔比星对膀胱癌细胞的杀伤活性和凋亡诱导活性，而单独采用二甲双胍效果不明显，表明二甲双胍与吡柔比星存在协同效应，能提高吡柔比星对膀胱癌的治疗效果。

XIAP属于抗凋亡蛋白家族成员，它能与天冬内切酶caspases结合，从而阻止caspases的活化，抑制凋亡的发生[6]。研究表明，肿瘤细胞中XIAP的过度表达能引起肿瘤细胞对化疗药物的抵抗，影响癌症患者的预后。因此XIAP目前已成为肿瘤治疗的一个靶点[7-9]。本研究发现，二甲双胍能显著下调膀胱癌细胞中XIAP蛋白的表达，抑制XIAP与caspase-9、caspase-7和caspase-3的相互作用。游离的caspases能在凋亡信号（吡柔比星）的作用下发生活化，最终导致细胞凋亡。因此，二甲双胍发挥协同效应的机制可能和XIAP的抑制有关。用表达质粒上调膀胱癌细胞中XIAP的表达，二甲双胍对吡柔比星的协同效应受到明显抑制，证明二甲双胍是通过下调膀胱癌细胞中XIAP的蛋白表达来增强吡柔比星介导的caspase-9、caspase-7和caspase-3的活化，导致细胞凋亡性死亡。

综上所述，二甲双胍对吡柔比星有协同抗膀胱癌效应，其机制可能与二甲双胍能下调膀胱癌细胞中XIAP的表达水平有关。本文结果为降低吡柔比星的使用剂量并提高其疗效提供了新的策略和思路。

[1] Wu K，Wang B，Fan J，et al.DAB2IP regulates the chemoresistance to pirarubicin and tumor recurrence of non-muscle invasive bladder cancer through STAT3/Twist1/P-glycoprotein signaling.Cell Signal，2015，27（12）:2515

[2] Ahmed SM，Wu X，Kakehi Y，et al.Synergistic induction of apoptosis by mapatumumab and anthracyclines in human bladder cancer cells.Oncol Rep，2015， 33（2）:566

[3] Chen G1，He Y，Jing P，et al.In vitro and in vivo studies of pirarubicin-loaded SWNT for the treatment of bladder cancer.Braz J Med Biol Res，2012，45（8）:771

[4] Seabloom DE，Galbraith AR，Ondrey FG，et al.Fixed-dose combinations of pioglitazone and metformin for lung cancer prevention.Cancer Prev Res （Phila）， 2017，10:116

[5] Xie W，Wang L，Zhang K，et al.Metformin Induces Growth Inhibition and Cell Cycle Arrest by Upregulating Micro RNA34a in Renal Cancer Cells.Med Sci Monit， 2017，23:29

[6] Rodríguez-Berriguete G，Torrealba N，Royuela M，et al.Prognostic value of inhibitors of apoptosis proteins （IAPs） and caspases in prostate cancer:caspase-3 forms and XIAP predict biochemical progression after radical prostatectomy.BMC Cancer，2015，15:809

[7] Flanagan L，Kehoe J，Prehn JH，et al.High levels of X-linked Inhibitor-of-Apoptosis Protein （XIAP） are indicative of radio chemotherapy resistance in rectal cancer.Radiat Oncol，2015，10:131

[8] Werner TA，Tamkan-lcek Y，Krieg A，et al.Survivin and XIAP:two valuable biomarkers in medullary thyroid carcinoma.Br J Cancer，2016，114（4）:427

[9] Liu Y，Chen XD，Zhou ZG，et al.Deletion Of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-κB activity.Cell Death Dis，2017，8（3）:e2685