副猪嗜血杆菌灭活疫苗（SYS株）生产工艺的初步建立

常超，姜宇，杨朋欣

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

副猪嗜血杆菌灭活疫苗（SYS株）生产工艺的初步建立

常超，姜宇，杨朋欣

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

为制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗并对其生产工艺进行优化，试验分别对制苗过程的发酵工艺和灭活工艺进行优化，对制备的疫苗进行质量检测，并分析免疫效果。结果表明，制苗用含10%新生牛血清和15 μg·mL-1NAD的TSB培养基，并按培养基总量2%～4%分别接种副猪嗜血杆菌各菌株二级种子液，设定搅拌速度为100 r·min-1，37℃培养10 h收获菌液，可获得理想的制苗菌液；0.3%的甲醛于37℃灭活24 h，可完全灭活菌液。按照优化后的工艺制备的灭活疫苗是安全的。

副猪嗜血杆菌灭活疫苗；生产工艺；灭活检验

副猪嗜血杆菌病，又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，也称格拉泽氏病，是由副猪嗜血杆菌引起[1]。这种细菌在环境中普遍存在，世界各地都有，甚至是健康的猪群当中也能发现。随着世界养猪业的发展，规模化饲养技术的应用和饲养高度密集，以及突发新的呼吸道综合征等因素存在，使得该病日趋流行，危害日渐严重[2]。

对该病的控制一般采取抗生素治疗，但该方法易产生耐药性，因此疫苗的制备是控制该病较好的手段，本文对副猪嗜血杆菌疫苗制备生产工艺进行优化，获得安全、免疫效力良好的灭活产品，为副猪嗜血杆菌多价苗和联苗产品的制备提供参考。

1 试验材料

1.1 菌株和主要试剂及仪器

副猪嗜血杆菌血清4型SYS株由哈药集团生物疫苗有限公司分离鉴定。

甲醛溶液和NaCl均购自国药集团；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，V因子，氧化型辅酶I）购自LOCHE公司；新生犊牛血清购自GIBCO公司；TSA和TSB均购自OXOID；发酵罐购自福州福尔流体设备有限公司。

1.2 试验动物

3～5周龄健康易感猪，由哈药集团生物疫苗有限公司定点试验猪场提供，经间接血凝试验，其副猪嗜血杆菌间接血凝抗体效价≤1∶4。

2 试验方法

2.1 副猪嗜血杆菌生产用种子制备

取副猪嗜血杆菌SYS株冻干菌种分别用含NAD和新生牛血清的TSB培养基溶解，划线接种于含NAD和新生牛血清的TSA平皿上，置37℃培养24 h，挑选若干典型菌落，接种含NAD和新生牛血清的TSA固体培养基，37℃培养24 h，作为一级种子。用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子菌落，接种于含10%新生牛血清和15 μg·mL-1NAD的TSB培养基，置37℃振荡培养10 h，取样经纯检合格后作为二级种子。

2.2 二级种子接种量的优化

种子接种量是指接入种子体积和培养基体积的比例。制苗用含10%的新生牛血清和16 μg·mL-1NAD的TSB培养基。以1%、2%、4%和5%的比例分别接种SYS株二级种子，37℃培养，静止培养2 h后，设定搅拌速度为100 r·min-1，培养12 h，每隔2 h取样，进行活菌计数，测定不同接种量、不同培养时间菌液中的活菌数，确定二级种子的最佳接种剂量。

2.3 血清和NAD添加量的优化

按含15 μg·mL-1NAD的TSB培养基总量的5%、10%和15%的比例来添加血清，或按含10%血清的TSB培养基中NAD浓度分别为10、15、20 μg·mL-1的量分别接种2%的SYS株的二级种子，37℃培养，静止培养2 h，设定搅拌速度为100 r·min-1，培养12 h，每隔2 h取样，进行活菌计数，确定在TSB培养基中血清和NAD的最佳添加量。

2.4 按照优化条件培养副猪嗜血杆菌

根据上述试验的测定结果，得出制苗用含15 μg·mL-1NAD和10%血清的TSB培养基。按TSB培养基的总量2%分别接种副猪嗜血杆菌各菌株二级种子液，设定搅拌速度为100 r·min-1，37℃培养10 h收获菌液，进行活菌计数。

2.5 灭活方法优化

按照优化方法培养副猪嗜血杆菌，分别加入0.2%、0.3%和0.4%的甲醛溶液，然后取12、16、20、24和28 h灭活菌液进行灭活检验。

2.6 灭活菌液对试验猪的安全性试验

根据试验结果确定各菌株的灭活条件后，取灭活彻底的菌液，按4.0 mL·头-1的剂量颈部肌肉注射5周龄健康易感猪（副猪嗜血杆菌间接血凝效价≤1∶4）2头，连续观察14 d，观察试验猪的临床表现、健康状态及其有无局部及全身反应。

3 试验结果

3.1 不同二级种子接种量在不同培养时间的菌液中活菌浓度

副猪嗜血杆菌各菌株不同接种量、不同培养时间的菌液中活菌浓度见表1。考虑生产成本，确定副猪嗜血杆菌各菌株二级种子的接种量为2%～4%，培养时间为10 h。

表1 不同接种量、不同培养时间副猪嗜血杆菌HB株菌液浓度cfu·mL-1

3.2 血清和NAD添加量的试验结果

测定含不同血清含量的TSB培养基在不同培养时间菌液中的活菌浓度，试验结果见表2。测定含不同NAD含量的TSB培养基在不同培养时间菌液中的活菌浓度，试验结果见表3。根据以上试验结果，考虑生产成本，副猪嗜血杆菌各菌株血清添加量为10%，NAD添加浓度为15 μg·mL-1，在此添加条件下，培养8～10 h，副猪嗜血杆菌各菌株培养浓度较高，能满足抗原生产需要。

3.3 按照优化条件培养副猪嗜血杆菌各菌株

根据上述试验的测定结果，得出制苗用培含15 μg·mL-1NAD和10%血清的TSB培养基。按TSB培养基总量的2%分别接种副猪嗜血杆菌各菌株二级种子液，设定搅拌速度为100 r·min-1，37℃培养10 h收获菌液，活菌计数为7.2×109cfu·mL-1，能满足该菌的抗原生产需要。

表2 副猪嗜血杆菌SYS株在不同血清添加量下培养的活菌浓度cfu·mL-1

表3 副猪嗜血杆菌SYS株在不同NAD浓度下培养的活菌浓度cfu·mL-1

3.4 灭活方法优化试验结果

试验结果表明，在37℃条件下，甲醛溶液终浓度为0.3%时，灭活24 h可彻底灭活副猪嗜血杆菌各菌株菌液，试验结果见表4。

表4 灭活试验结果

3.5 副猪嗜血杆菌各灭活菌液对试验猪的安全性试验结果

根据灭活试验结果确定菌株菌液的灭活条件后，取灭活彻底的副猪嗜血杆菌各菌株菌液，按4.0 mL·头-1的剂量颈部肌肉注射5周龄健康易感猪（副猪嗜血杆菌间接血凝效价≤1∶4）5头，连续观察14 d，试验猪注射部位均未出现炎性反应，采食量及精神状态正常，均健活。

4 讨论

猪副嗜血杆菌只感染猪，可以影响从2周龄～4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达50%。由于各血清型之间无交叉保护，制备的单苗具有针对性[3-5]。因此，研制一种防治副猪嗜血杆菌病的安全性好的灭活疫苗具有重要的现实意义。本试验通过对制苗工艺的优化获得安全性较好的疫苗，在灭活时间上，20 h也可以，但考虑到生产风险等因素，选择更为稳定的24 h。

[1]陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社,2002.

[2]陈溥言.兽医传染病学[M].北京:中国农业出版社,2006.

[3]王艳.副猪嗜血杆菌灭活疫苗的研制[D].南京:南京农业大学,2006.

[4]苏丹萍,王文豪,章胜,等.副猪嗜血杆菌弱毒疫苗的研制[J].中国畜牧兽医,2012,39（11）:169-173.

[5]张颖.猪副猪嗜血杆菌病诊治[J].四川畜牧兽医,2013,40（8）:54.

Preliminary Establishment of Inactivated Vaccine Against Haemophilus Suis(SYS strain)

CHANG Chao,JIANG Yu,YANG Pengxin

（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

To prepare inactivated vaccine against Haemophilus suis and optimized its production process,the fermentation process and inactivation process were optimized,and the quality of the prepared vaccine was tested,and the immune effect was analyzed in this experiment.The results showed that using TSB medium that containing 10%of newborn calf serum and 15 μg·mL-1NAD to prepare vaccine and 2%～4%medium respectively according to total of two stage seed inoculation of Haemophilus parasuis strains,setting the stirring speed of 100 r·min-1,after 10 h cultured at 37℃,the ideal harvested liquid was obtained;the bacterial fluid could be completely inactivated⁃with 0.3%formaldehyde inactivated 24 h at 37℃.The inactivated vaccine prepared according to the optimized pro⁃cess was safe.

inactivated vaccine against Haemophilus suis;production process;inactivated test

S852.61+2；S828

A

1001-0084（2017）10-0035-03

2017-09-16

常超（1985-），男，黑龙江佳木斯人，中级兽医师，主要从事于动物生物制品。