普萘洛尔及异丙肾上腺素对婴儿血管瘤内皮细胞β2肾上腺素受体表达的影响

朱雅琳 马龙 帕丽达·阿布利孜

830054乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院皮肤科

普萘洛尔及异丙肾上腺素对婴儿血管瘤内皮细胞β2肾上腺素受体表达的影响

朱雅琳 马龙 帕丽达·阿布利孜

830054乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院皮肤科

目的探讨β2肾上腺素受体在婴儿血管瘤发病机制中的作用。方法婴儿血管瘤内皮细胞分为普萘洛尔组及异丙肾上腺素组。普萘洛尔组再分为10、15、20 μg/ml组、空白组及二甲基亚砜（DMSO）组5组，异丙肾上腺素组再分为5、10、20 μg/ml组、空白组4组。血管瘤内皮细胞与这些组作用24 h、48 h，用酶联免疫吸附法分别测定每浓度细胞培养上清液中β2肾上腺素受体的表达。结果 作用24 h后，15 μg/ml、20 μg/ml组普萘洛尔与空白组和DMSO组比较，β2肾上腺素受体的表达下降，差异有统计学意义（均P＜0.05）。48 h后，普萘洛尔组各浓度培养的细胞，β2肾上腺素受体表达较空白组下降，差异有统计学意义（均P＜0.05）。而异丙肾上腺素组，作用24 h后，10 μg/ml、20 μg/ml组的异丙肾上腺素较空白组β2肾上腺素受体的表达增高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。48 h后，20 μg/ml组异丙肾上腺素培养的细胞上清液中的β2肾上腺素受体表达较空白组高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。结论普萘洛尔对血管内皮细胞表面的β2肾上腺素受体表达的影响下调，而异丙肾上腺素作用上调。

血管瘤；婴儿；内皮细胞；普萘洛尔；异丙肾上腺素；受体，肾上腺素能β2

自Léauté⁃Labrèze等［1］报道普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的疗效以来，大量的病例报告与研究发现，普萘洛尔对婴儿血管瘤内皮细胞（IHEC）的治疗起效快，常于给药后24 h即可使瘤体颜色由红变紫，组织软化，大部分IHEC在48 h到1个月便可出现生长停滞［2⁃3］，但其作用机制尚不明了。由于普萘洛尔为一种β受体拮抗剂，尤其是β2受体在血管瘤发病机制中的作用渐成为研究的热点。本研究通过普萘洛尔和异丙肾上腺素作用于体外培养的血管瘤内皮细胞24 h、48 h，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测β2肾上腺素受体的表达，从而探讨β2肾上腺素受体在婴儿血管瘤发病机制中的作用。

一、资料

1.样本来源：血管瘤标本来自临床手术切除的血管瘤2例，通过组织病理诊断为增殖期血管瘤。患儿父母均签署知情同意书。

2.试剂与仪器：普萘洛尔（天津力生制药股份有限公司），异丙肾上腺素（上海丰禾制药有限公司）。EGM™⁃2MV Bullet试剂盒（瑞士Lonza公司）。兔抗人血友病因子（von Willebrand factor，vwf）多克隆抗体、聚合辣根过氧化物酶（HRP）标记抗兔IgG、兔抗人血管内皮细胞生长因子受体2抗体（VEGFR⁃2，武汉博士德生物工程有限公司）。抗人CD31 FITC、鼠 抗 IgG1 K Isotype Control FITC（ 美 国eBioscience公司），AnnexinV⁃FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（上海BestBio贝博生物）。MACSQuant流式细胞仪（德国Miltenyi Biotec公司）。使用ELISA检测β2肾上腺素受体的表达。

二、方法

1.血管瘤内皮细胞的原代培养［4］：手术切除血管瘤标本立即放入无血清培养基储存，并迅速移至实验室超净台处理，然后加入EGM⁃2培养基并移入25 cm2培养瓶，放入37℃CO2培养箱。24 h后观察细胞贴壁，换液。随后每2～3天换液，细胞铺满瓶底70%～80%以上传代，所有操作均在超净台完成，全程无菌操作。

2.含药物培养基配置：用二甲基亚砜（DMSO）溶解普萘洛尔，然后用EGM⁃2培养基进行稀释，制备10、15、20 μg/ml浓度普萘洛尔液；DMSO终浓度为0.16%。同时用EGM⁃2培养基稀释异丙肾上腺素，配制浓度分别为5、10、20 μg/ml含异丙肾上腺素培养基备用。

3.血管瘤内皮细胞准备：取前期［5］实验的原代培养及鉴定后的2～3代血管瘤内皮细胞，在6孔板中调整细胞浓度为3 × 105/ml，每孔2 ml。随后将6孔板放置37 ℃、5%CO2培养条件下24 h，镜下观察贴壁。随后换液为含有药物的培养基。将细胞分为两组，用于普萘洛尔和异丙肾上腺素干预。普萘洛尔组再分空白组、10、15、20 μg/ml组、DMSO组，每组4个复孔取均值，分别使用含不同浓度普萘洛尔培养基作用及DMSO和空白培养基作用24 h和48 h。异丙肾上腺素组再分空白组、5、10、20 μg/ml组，每组4个复孔取均值，分别用不同浓度异丙肾上腺素培养基作用24 h和48 h，用ELISA分别检测各组β2肾上腺素受体表达。

4.统计方法：采用SPSS17.0软件进行分析。计量资料进行正态性检验和方差齐性检验，符合条件使用方差分析进行比较，检验若有差异，则进行两两比较，方差不齐则使用Dunnett⁃t检验。

三、结果

1.血管瘤内皮细胞在各种浓度的普萘洛尔培养基培养24 h、48 h后检测β2肾上腺素受体的表达：作用24 h后，15 μg/ml和20 μg/ml普萘洛尔组较空白组和DMSO组β2肾上腺素受体的表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。48 h后，各浓度组普萘洛尔培养的细胞β2肾上腺素受体表达较空白组均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 普萘洛尔各浓度组作用24、48 hβ2肾上腺素受体含量（±s） pg/ml

表1 普萘洛尔各浓度组作用24、48 hβ2肾上腺素受体含量（±s） pg/ml

注：n=4。a：与空白组比较，P＜0.05

组别普萘洛尔组0（空白）10 μg/ml 15 μg/ml 20 μg/ml二甲基亚砜组24 h 48 h 54.13±6.407 41.45±3.618 36.93±4.402a 28.05±7.107a 52.260±3.894 99.03±7.684 81.05±15.38a 71.08±4.229a 67.16±1.444a 97.160±4.112

2.血管瘤内皮细胞在5、10、20 μg/ml的异丙肾上腺素培养基培养24 h、48 h检测β2肾上腺素受体的表达：作用24 h后，10 μg/ml和20 μg/ml异丙肾上腺素组较空白组β2肾上腺素受体的表达增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。48 h后，20 μg/ml组β2肾上腺素受体表达较空白组增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 异丙肾上腺素处理24、48 h细胞培养上清液β2肾上腺素受体含量（±s） pg/ml

表2 异丙肾上腺素处理24、48 h细胞培养上清液β2肾上腺素受体含量（±s） pg/ml

注：n=4。a：与空白组比较，P＜0.05；b：与5 μg/ml比较，P＜0.05；c：与10 μg/ml比较，P＜0.05

组别异丙肾上腺素浓度0（空白）5 μg/ml 10 μg/ml 20 μg/ml 24 h 48 h 52.260±3.894 65.830±6.208 72.650±1.937a 97.230±11.140abc 97.160±4.112 105.300±19.79 132.500±9.943 176.300±15.210abc

四、讨论

Denoyelle等［6］在治疗血管瘤时，将糖皮质激素与普萘洛尔联合应用，比单独糖皮质激素疗效更好。在治疗严重危及生命的血管瘤患儿时，普萘洛尔以其不良反应小、疗效佳的优点，临床已广泛使用。普萘洛尔是一种非选择性β肾上腺素受体阻断剂，可阻断细胞膜上β1、β2肾上腺素受体结合，而对β3无作用。β1肾上腺素受体被激活后，与细胞膜上激活型G蛋白（Gs）耦连，使后者发生构象改变并产生活性，在血管瘤内，普萘洛尔通过抑制β2肾上腺素受体及信号通路，造成血管收缩，血管瘤内供血减少，表现为鲜红色的增殖期皮肤血管瘤颜色变浅，质地变软。这个理论可以解释，口服普萘洛尔后血管瘤患儿病情能够得到迅速的改善［1］。有研究认为［7］，普萘洛尔和β2肾上腺素受体抑制剂均能促进血管内皮细胞的凋亡，且作用明显强于β1肾上腺素受体抑制剂。

本研究显示，使用含有不同浓度的普萘洛尔和异丙肾上腺素的培养基作用于血管瘤内皮细胞24 h、48 h后，β2肾上腺素受体的表达受到一定影响。普萘洛尔作用于血管瘤内皮细胞后，β2肾上腺素受体的表达下调，但与药物浓度和时间有关。而异丙肾上腺素的作用恰与普萘洛尔相反，刺激了β2肾上腺素受体的上调，说明β受体阻断剂对血管瘤内皮细胞膜表面β2受体表达影响细胞增殖。结合以往研究，普萘洛尔作用于血管瘤内皮细胞之后，除阻断受体及其下游的信号转导，同时减少血管内皮细胞生长因子，血管内皮细胞生长因子2，碱性成纤维细胞生长因子的分泌，抑制细胞增殖外，还下调血管瘤内皮细胞β2肾上腺素受体的表达，减少β2肾上腺素受体激动信号的传入。从而进一步抑制细胞的增殖和分化，而异丙肾上腺素的作用则正好相反。异丙肾上腺素和普萘洛尔对于β2肾上腺素受体的表达影响也呈现拮抗，是否与上述的信号转导通路有关，还是在信号通路之外或有其他的调节反馈系统尚不清楚，需要进一步研究。

［2］Zheng M,Zhu W.Han Q,et a1.Emerging concepts and therapeutic implications of beta ⁃adrenergic receptor subtype signaling［J］.Pharmacol Ther,2005,108（3）:257 ⁃268.DOI:10.1016/j.pharmthera.2005.04.006.

［3］Hogeling M,Adams S,Wargon O.A randomized controlled trial of propranolol for infantile hemangiomas［J］.Pediatrics,2011,128（2）:e259⁃e266.DOI:10.1542/peds.2010⁃0029.

［4］聂晶,帕提古丽·买买提托合提,朱雅琳.异丙肾上腺素对婴儿血管瘤内皮细胞影响的体外研究［J］.新疆医科大学学报,2015,38（7）:839⁃842.DOI:10.3969/j.issn.1009⁃5551.2015.07.010.

［5］Zhu Y,Tuerxun A,Hui Y,et al.Effects of propranolol and isoproterenol on infantile hemangioma endothelial cellsin vitro［J］.Exp Ther Med,2014,8（2）:647⁃651.

［6］Denoyelle F,Leboulanger N,Eajolras O,et al.Role of propranolol in the therapeutic strategy of infantile laryngotrachealhaemangioma［J］.Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2009,73（8）:1168⁃1172.DOI:10.1016/j.ijporl.2009.04.025.

［7］Schuller HM.Neurotransmitter receptor⁃mediated signaling path⁃ways as modulators of carcinogenesis［J］.Prog Exp Tumor Res,2007,39:45⁃63.DOI:10.1159/0000100045.

［1］Léauté⁃Labrèze C,Dumas de la Roque E,Hubiche T,et al.Propanolol for severe hemangiomas of infancy［J］.N EngI J Med,2008,358（24）:2649⁃2651.DOI:10.1056/NEJMc0708819.

In vitroeffects of propranolol and isoproterenol on the expression of beta⁃2 adrenergic receptor on infantile hemangioma endothelial cells

Zhu Yalin,Ma Long,Paride Abliz
Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China

Paride Abliz,Email:palidae@aliyun.com

ObjectiveTo explore the role of beta⁃2 adrenergic receptor in the pathogenesis of infantile hemangioma.MethodsIn vitrocultured infantile hemangioma endothelial cells were divided into propranolol and isoproterenol groups.The propranolol groups were further classified into 5 groups to be treated with propranolol solutions at concentrations of 10,15,20 μg/ml,EGM⁃2 medium（blank control group 1）,and EGM ⁃2 medium containing 0.16%DMSO （DMSO group） respectively,while the isoproterenol groups were classified into 4 groups to be treated with isoproterenol solutions at concentrations of 5,10,20 μg/ml and EGM⁃2 medium（blank control group 2）respectively.After 24⁃and 48⁃hour treatment,enzyme⁃linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to measure the expression of beta⁃2 adrenergic receptor in cell culture supernatants in the above groups.ResultsAfter 24⁃hour treatment,15⁃μg/ml and 20⁃μg/ml propranolol groups showed significantly decreased expression of beta⁃2 adrenergic receptor compared with blank control group 1 and DMSO group（all P ＜ 0.05）.After 48⁃hour treatment,all the propranolol groups showed significantly decreased expression of beta⁃2 adrenergic receptor compared with the blank control group 1（allP＜ 0.05）.However,the expression of beta⁃2 adrenergic receptor was significantly higher in the 10⁃and 20⁃μg/ml isoproterenol groups than in the blank control group 2 after 24⁃hour treatment（allP＜ 0.05）,and higher in the 20⁃μg/ml isoproterenol group than in the blank control group 2 after 48⁃hour treatment（P＜ 0.05）.ConclusionPropranolol can down⁃regulate the expression of beta⁃2 adrenergic receptor on the surface of vascular endothelial cells,while isoproterenol can up⁃regulate its expression.

Hemangioma;Infant;Endothelial cells;Propranolol;Isoproterenol;Receptors,adre⁃nergic,beta⁃2

帕丽达·阿布利孜，Email：palidae@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.09.014

2016⁃08⁃08）

（本文编辑：吴晓初）