重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗银屑病及其对白细胞介素17A和肿瘤坏死因子α的影响

仝云蕾 陈铭 龚瑜 张玲玲 于倩 王瑶 史玉玲

200072上海，同济大学附属第十人民医院皮肤科（仝云蕾、龚瑜、张玲玲、于倩、王瑶、史玉玲），健康体检科（陈铭）

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗银屑病及其对白细胞介素17A和肿瘤坏死因子α的影响

仝云蕾 陈铭 龚瑜 张玲玲 于倩 王瑶 史玉玲

200072上海，同济大学附属第十人民医院皮肤科（仝云蕾、龚瑜、张玲玲、于倩、王瑶、史玉玲），健康体检科（陈铭）

目的探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR：Fc，商品名益赛普）联合甲氨蝶呤对中重度斑块型银屑病患者血清和单个核细胞中白细胞介素（IL）17A和肿瘤坏死因子（TNF⁃α）的影响。方法2014年8月至2016年2月同济大学附属第十人民医院皮肤科门诊收治的30例中重度斑块型银屑病患者，分为益赛普组（15例）和益赛普+甲氨蝶呤组（15例），疗程24周。采用酶联免疫吸附法（ELISA）和实时定量PCR法检测两组患者治疗前后血清和外周血单个核细胞的IL⁃17A和TNF⁃α的浓度和mRNA表达水平。结果治疗前益赛普+甲氨蝶呤组和益赛普组患者，血清IL⁃17A，TNF⁃α水平以及外周血PBMC中IL⁃17A，TNF⁃α mRNA的表达均显著高于健康对照组（P＜0.05）；治疗后，益赛普 + 甲氨蝶呤组血清IL⁃17A、TNF⁃α浓度（142.67± 14.82，70.07± 25.02）及外周血PBMC中IL⁃17A、TNF⁃α mRNA表达（1.12± 0.33，2.50± 1.04）与益赛普组血清IL⁃17A、TNF⁃α浓度（163.54±23.18，91.98±14.62）及外周血PBMC中IL⁃17A、TNF⁃α mRNA的表达（1.56±0.77，3.61±2.14）比较显著下降（P＜0.05）。结论益赛普联合甲氨喋呤治疗银屑病疗效优于单用益赛普治疗，联合治疗可以缩短治疗时间，提高疗效，其作用机制可能与下调IL⁃17A、TNF⁃α的表达量有关。

银屑病；受体，肿瘤坏死因子，Ⅱ型；重组融合蛋白质类；甲氨蝶呤；白细胞介素17；肿瘤坏死因子α

银屑病是一种环境、遗传、免疫等多因素诱导的炎症性皮肤病，发病机制尚不明确。已有研究报道，其发病与多种炎症因子参与有关，白细胞介素（IL）17和肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）是银屑病发病机制中的重要促炎性细胞因子［1］。银屑病的治疗多种多样，生物制剂作为免疫靶向治疗药物显示出良好的疗效。重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR：Fc，商品名益赛普）作为一种肿瘤坏死因子拮抗剂，近年来已应用于临床，且疗效确切［2］，由于其价格昂贵及长期应用的经济负担，使其在应用上受到限制，于是生物制剂与传统药物联合治疗银屑病应运而生［3］，其中益赛普与甲氨蝶呤（MTX）的联合已应用于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎及银屑病，能有效地抑制炎症，改善病情［4］。我们观察益赛普联合MTX治疗中重度斑块型银屑病的疗效，检测治疗前后血清IL⁃17A，TNF⁃α的水平及外周血单个核细胞（PBMC）IL⁃17A mRNA、TNF⁃α mRNA的表达。

对象与方法

一、对象

2014年8月至2016年2月，同济大学附属第十人民医院皮肤科门诊就诊30例中重度斑块型银屑病患者，均经临床或组织病理确诊。采集30例患者的临床资料和外周血标本，男20例，女10例，年龄25～73（51.93±14.72）岁，病程（19.40±10.27）年，银屑病皮损面积和严重度指数（PASI）为（26.64±8.95）分。益赛普+MTX组15例，单用益赛普组15例。两组性别、年龄、病期及症状体征等比较，差异无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。健康对照组15例，均为健康献血员，男9例，女6例，年龄18～60（37.47±12.72）岁。本研究通过本院医学伦理委员会批准，所有患者和健康对照者均签署知情同意书。

1.入选标准：年龄≥18岁；病程≥6个月；PASI评分＞10且皮损面积＞体表面积10%的中重度斑块型银屑病；接受过至少1种系统治疗但疗效不佳，研究者认为患者适合接受本方法治疗。30例患者入组前2个月内未接受过系统治疗，2周内未外用治疗银屑病药物。

2.排除标准：其他类型银屑病（红皮病性、脓疱性、关节病性），或其他可能干扰病情评估的皮肤病；以前接受过生物制剂治疗者；有药物引起的银屑病；筛选阶段前6个月内患有机会性感染；孕妇、哺乳期妇女；患有活动性结核病史或近期与活动性结核病患者密切接触史；患有严重的未控制的心血管、肝脏、肺和肾疾病、其他自身免疫性疾病、恶性肿瘤、HIV感染；研究者认为合并有不适合参加本研究的其他疾病。

二、方法

1.治疗方案：益赛普+MTX组：皮下注射益赛普每周1次50 mg，连续24周；第1、2周口服MTX 7.5 mg/周，第 3、4 周口服 10 mg/周，第 5、6周口服2.5 mg/周，第7～24周口服15 mg/周。益赛普组：皮下注射益赛普每周1次50 mg，连续24周。益赛普由中信国健药业有限公司生产（国药准字S20050058）。MTX由上海信谊药厂生产。

2.酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清IL⁃17A、TNF⁃α的含量：采集患者及健康人静脉血4 ml，分离血清，用ELISA法检测血清IL⁃17A、TNF⁃α水平（试剂盒由美国Multisciences公司提供），实验步骤按照试剂盒说明书进行。采用多功能酶标仪测定450 nm处吸光度值，根据标准曲线读取样品浓度。

3.实时定量PCR（RT⁃PCR）检测外周血单个核细胞（PBMC）中IL⁃17A、TNF⁃α mRNA表达：采集患者及健康人EDTA抗凝外周静脉血4 ml，用Ficoll⁃Hypaque密度梯度离心法获得PBMC，冻存于-80℃。用RT⁃PCR方法检测外周血中IL⁃17A、TNF⁃α的mRNA水平。

（1）总RNA的提取：将分离的PBMC加入1 ml Trizol，按RNA抽提试剂盒说明提取总RNA。紫外分光光度法测定RNA浓度（ng/ul），计算A260/A280比值，鉴定RNA纯度。

（2）根据日本TaKaRa公司反转录试剂盒提供的方法将总RNA反转录为cDNA，按10 μl的反应体系配制RT反应液，总RNA为500 ng，反转录cDNA置于-20℃冰箱保存。

（3）实时PCR反应：引物设计和引物合成均由上海捷瑞生物工程有限公司提供。IL⁃17：正向引物：5′⁃TTGATGCTCTCGCTCTTC⁃3′，反向引物：5′⁃CTTCCTCCTCTTCCTCCA⁃3′；TNF⁃α：正向引物：5′⁃TCCTTCAGACACCCTCAACC⁃3′，反向引物：5′⁃AGG CCCCAGTTTGAATCCTT⁃3′；内参照β肌动蛋白：正向引物：5′⁃AGAGCTACGAGCTGCCTGAC⁃3′，反向引物：5′⁃AGCACTGTGTTGGCGTACAG⁃3′。PCR反应体系为SYBR Premix EX TaqⅡ（2 ×）10 μl，ROX Reference DyeⅡ（50 ×）0.4 μl，F⁃primer（10 μmol/L）0.8 μl，R ⁃primer（10 μmol/L）0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH20 6 μl。反应条件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃30 s、40个循环；得到每个标本不同指标的Ct值，根据公式2⁃ΔΔCt计算出IL⁃17A、TNF⁃α的mRNA相对表达量。

4.药物不良反应监测：两组患者在治疗前均进行结核菌素试验，乙肝5项以及胸部CT检查，排除结核和乙肝病毒的感染。治疗前、治疗第2周、第4周，以后每4周1次血尿常规，C反应蛋白和肝肾功能检测。

5.疗效评估标准：记录两组治疗前后的PASI评分，并计算第24周时的PASI75应答率。

6.统计学处理：采用SPSS 20统计学软件，计量资料以±s表示，两组间采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、血清IL⁃17A、TNF⁃α的水平及外周血PBMC中IL⁃17A，TNF⁃α mRNA表达

益赛普组和益赛普+MTX组患者治疗前血清IL⁃17A，TNF⁃α水平均显著高于健康对照组（P＜0.05）；治疗后血清IL⁃17A、TNF⁃α水平较治疗前明显下降（P＜0.05），但仍高于健康对照组；两组患者治疗前外周血PBMC中IL⁃17A，TNF⁃α mRNA表达均显著高于健康对照组（P＜0.05）；治疗后PBMC中IL⁃17A，TNF⁃α mRNA表达较治疗前明显下降（P＜0.05），但仍高于健康对照组。同时对益赛普组和益赛普+MTX组治疗前后血清中IL⁃17A，TNF⁃α水平以及外周血PBMC中IL⁃17A，TNF⁃α mRNA表达水平进行了比较，发现治疗前益赛普组血清中IL⁃17A，TNF⁃α水平以及外周血PBMC中IL⁃17A mRNA，TNF⁃α mRNA表达与益赛普+MTX组比较差异无统计学意义（均P＞0.05），而益赛普+MTX组治疗后血清IL⁃17A、TNF⁃α水平及PBMC中IL⁃17A、TNF⁃α mRNA的表达与益赛普组治疗后比较均降低（均P＜ 0.05），而两组治疗后血清中IL⁃17A、TNF⁃α水平及PBMC中IL⁃17A、TNF⁃α mRNA的表达仍高于正常健康组。见表1。

表1 健康对照组和银屑病组治疗前后血清IL⁃17A、TNF⁃α以及外周血单个核细胞中IL⁃17A、TNF⁃α mRNA的表达（±s）

表1 健康对照组和银屑病组治疗前后血清IL⁃17A、TNF⁃α以及外周血单个核细胞中IL⁃17A、TNF⁃α mRNA的表达（±s）

注：a：与健康对照组比较，P＜0.05；b：与治疗前比较，P＜0.05；c：与益赛普组治疗后比较，P＜0.05。IL：白细胞介素；TNF：肿瘤坏死因子

组别健康对照组益赛普组治疗前治疗后益赛普+MTX组治疗前治疗后例数15 15 IL⁃17A（pg/ml）119.98±32.03 TNF⁃α（pg/ml）64.80±47.88 IL⁃17A mRNA 0.99±0.03 TNF⁃α mRNA 1.01±0.06 196.22±31.85a 163.54±23.18ab 128.81±55.70a 91.98±14.62ab 5.63±3.61a 1.56±0.77ab 10.57±4.02a 3.61±2.14ab 15 201.54±28.47a 142.67±14.82abc 104.44±49.43a 70.07±25.02abc 5.93±2.44a 1.12±0.33abc 8.69±4.03a 2.50±1.04abc

二、治疗前后患者PASI评分比较

益赛普+MTX组治疗前PASI为22.97±7.09，治疗后为5.31±2.35，治疗前后PASI评分比较差异有统计学意义（t=13.84，P＜0.001），第24周PASI75应答率为80%；益赛普组治疗前PASI评分为30.31±9.32，治疗后为7.10±2.94，治疗前后PASI评分比较差异有统计学意义（t=12.506，P＜0.001），第24周的PASI75应答率为67%。益赛普+MTX组与益赛普组相比，PASI评分下降明显，且益赛普+MTX治疗组第24周的PASI75应答率较益赛普组有显著提高。因此，益赛普+MTX组与益赛普组相比，疗效更显著。

三、不良反应

益赛普+MTX组5例肝功能异常（肝酶轻度升高，随访肝功能未继续升高，均完成治疗疗程），出现尿蛋白、尿糖异常、失眠各1例，1例出现发热，白细胞升高，对症处理后好转。益赛普组出现眩晕、嗜睡、瘙痒、尿糖异常各1例，1例出现发热，白细胞升高，在发热期间对症处理后好转。总体来看，益赛普+MTX组的不良反应略高于益赛普组，但是患者均能耐受，不影响治疗。

讨 论

银屑病的发病机制尚不清楚，越来越多的证据表明，免疫介导的炎症性细胞因子是银屑病炎症过程中的关键因素。IL⁃17是Th17细胞分泌的代表性细胞因子，家族成员包括IL⁃17A～F6个，其中IL⁃17A有强大的致炎性，可促进机体产生各种趋化因子，促进炎症细胞趋化，从而诱导表皮的角质形成细胞产生多种细胞因子及抗菌肽，加重局部的炎症［5］，因此IL⁃17在银屑病的发病中起着重要作用。同时IL⁃17可以诱导多种炎症介质的释放，也被认为是一种前炎症因子［6］。已有相关报道，在银屑病患者的血清中IL⁃17A的表达明显高于正常人，与疾病的严重程度（PAS1评分）有相关性，提示Thl7细胞介导银屑病的发生发展［7］。TNF⁃α是T细胞分泌的多种细胞因子之一，在寻常型银屑病的发病过程中起着重要的促炎作用。TNF⁃α作为重要的早期炎症细胞因子，能够诱导刺激炎症细胞产生并释放炎性细胞因子，进而促使炎症细胞及炎性因子的黏附及聚集在炎症部位，从而参与炎症的发生发展，但是TNF⁃α只有和其受体结合后才能发挥其生物活性，如果阻断了TNF⁃α与受体的结合就会降低其生物活性［8］。已有报道，在银屑病患者的血清中TNF⁃α水平及外周血PBMC中TNF⁃α mRNA的表达均明显增高。

益赛普主要作用机制是通过和血中的肿瘤坏死因子（TNF）竞争性结合，阻断TNF和细胞表面的TNF受体结合，从而降低其活性达到减轻炎症反应的目的，改善银屑病患者的症状和体征［9］。从益赛普的结构看，主要靶点是TNF⁃α，但是参与银屑病发病的炎症因子是个复杂的网络，益赛普在治疗银屑病的过程中是否对其他炎症因子有影响尚不明确［10］，有待进一步研究。MTX是一种治疗银屑病的药物，具有免疫抑制和抗炎作用，主要是通过抑制二氢叶酸还原酶及甲酰基转移酶的生物活性，从而抑制各种促炎性细胞因子及趋化因子的释放，发挥抗炎作用［11］。虽然MTX疗效确切，但长期应用的毒副作用限制了应用。越来越多文献报道MTX与生物制剂联合应用，一方面提高了生物制剂单用的疗效，起效更快，另一方面提高了安全性［12］。本研究发现，MTX与益赛普联合应用与单用益赛普相比疗效更佳，PASI75的应答率明显提高，临床疗效更加显著。

本研究发现，银屑病患者血清中IL⁃17A及TNF⁃α水平及外周血PBMC中IL⁃17A、TNF⁃α mRNA的表达明显升高，同时治疗后血清中IL⁃17A及TNF⁃α水平及外周血PBMC中IL⁃17A、TNF⁃α mRNA的表达显著降低。在TNF⁃α抑制剂治疗中，抗药物抗体（anti⁃drug antibodies，ADA）的产生是在治疗中不希望出现的，然而几乎所有的TNF⁃α抑制剂都可能会产生ADA［13］，免疫抑制剂的使用可以降低所有来源（嵌合、人源化）的抗TNF⁃α抑制剂ADA的发生率，因此，MTX可以作为抗TNF⁃α药物ADA产生的基础免疫抑制剂，生物制剂和免疫抑制剂联用后疗效增强可能与患者体内单克隆抗体暴露量增多有关［14］。抗TNF⁃α抗体清除率下降的可能机制是在免疫抑制剂存在的情况下，单克隆抗体的免疫原性下降了，从而ADA的产生下降。其他的可能机制还有单克隆抗体和药物之间的相互作用，例如MTX下调Fc受体在单克隆细胞中的表达，可能会导致抗TNF⁃α抗体的分布改变。益赛普通过竞争性的结合TNF⁃α，从而抑制其生物活性，通过复杂的炎性因子网络的相互作用从而减少IL⁃17A，IL⁃22，IL⁃23，TNF⁃α等细胞因子的产生，减轻炎症的发生；同时甲氨蝶呤也可以通过抑制二氢叶酸还原酶及甲酰基转移酶的生物活性，进一步抑制IL⁃17A、TNF⁃α等细胞因子的释放，发挥抗炎作用，因此两者联合应用后IL⁃17A、TNF⁃α较单独应用有明显的下降，从而联合治疗更好地发挥了抗炎作用。

声明 本文无药厂资助，无利益冲突

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Recombinant human tumor necrosis factor receptor typeⅡ:IgG Fc fusion protein combined with methotrexate for the treatment of psoriasis and their effects on levels of interleukin⁃17A and tumor necrosis factor⁃α

Tong Yunlei,Chen Ming,Gong Yu,Zhang Lingling,Yu Qian,Wang Yao,Shi Yuling
Department of Dermatology,Tenth People′s Hospital of Tongji University,Shanghai 200072,China（Tong YL,Gong Y,Zhang LL,Yu Q,Wang Y,Shi YL）;Department of Physical Examination,Tenth People′s Hospital of Tongji University,Shanghai 200072,China（Chen M）

Shi Yuling,Email:shiyuling1973@tongji.edu.cn

ObjectiveTo evaluate the effect of recombinant human tumor necrosis factor receptor type Ⅱ:IgG Fc fusion protein（rhTNFR:Fc,trade name Etanercept）combined with methotrexate on levels of interleukin⁃17A（IL⁃17A）and tumor necrosis factor⁃α（TNF⁃α）in the serum and mononuclear cells of patients with moderate to severe plaque psoriasis.MethodsA total of 30 patients with moderate to severe plaque psoriasis were enrolled from Department of Dermatology of Tenth People′s Hospital of Tongji University between August 2014 and February 2016,and then were randomly and equally divided into Etanercept group and Etanercept+methotrexate group.The treatment lasted 24 weeks.Fifteen healthy blood donors served as healthy control group.Enzyme⁃linked immunosorbent assay（ELISA）and real⁃time quantitative PCR were performed to measure the serum levels and mRNA expression of IL⁃17A and TNF⁃α,respectively,in the patients of the above two groups before and after the treatment.ResultsBefore the treatment,the serum levels of IL⁃17A and TNF⁃α,as well as the mRNA expression of IL⁃17A and TNF⁃α in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）,were all significantly higher in all the patients than in the healthy controls（allP＜ 0.05）.After the treatment,compared with the Etanercept group,the Etanercept+methotrexate group showed significantly lower serum levels of IL⁃17A（142.67±14.82vs.163.54±23.18,P＜0.05）andTNF⁃α（70.07±25.02vs.91.98±14.62,P＜ 0.05）,aswellaslowermRNAexpressionofIL⁃17A（1.12±0.33vs.1.56±0.77,P＜0.05）and TNF⁃α in PBMCs（2.50±1.04vs.3.61±2.14,P＜0.05）.ConclusionEtanercept combined with methotrexate is superior to Etanercept alone in the treatment of psoriasis,and can reduce treatment duration and improve therapeutic effect,likely by down⁃regulating the expression of IL⁃17A and TNF⁃α.

Psoriasis;Receptors,tumor necrosis factor,type II;Recombinant fusion proteins;Methotrexate;Interleukin⁃17;Tumor necrosis factor⁃alpha

史玉玲，Email：shiyuling1973@tongji.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.09.004

国家自然科学基金（81673050、81301356）；上海市自然科学基金（16ZR1426800）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81673050,81301356）;Shanghai Municipal Natural Science Foundation（16ZR1426800）

2016⁃12⁃21）

（本文编辑：吴晓初）