MK801抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的实验研究

李 雪 郭玉婷

1山东中医药大学2015级在读研究生，济南 250355 2山东中医药大学第二附属医院，济南 250001

10.3969/j.issn.1674-4616.2017.03.006

△通信作者，Corresponding author，E-mail：zhmqlw@sina.com

MK801抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的实验研究

李 雪1郭玉婷2△

1山东中医药大学2015级在读研究生，济南 2503552山东中医药大学第二附属医院，济南 250001

目的研究NMDA受体1(NMDA receptor1，NMDAR1)抑制剂MK801对人结肠癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其机制。方法建立人结肠癌HT-29细胞株裸鼠移植瘤模型，分为实验组和对照组，实验组给予MK801 0.6 mg/(kg·d)腹腔注射给药，对照组腹腔注射等量生理盐水，给药4周后处死裸鼠并称取瘤重，采用免疫组织化学法检测2组肿瘤组织中NMDAR1的表达变化。结果实验组裸鼠的肿瘤体积明显小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，实验组肿瘤组织中NMDAR1的表达明显减少(P<0.01)。结论NMDAR1抑制剂MK801通过抑制NMDAR1的表达来抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长。

NMDAR1抑制剂；MK801；结肠癌；裸鼠；移植瘤

结直肠癌是人类高发恶性肿瘤，其发病率正逐年升高，在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位，男性仅次于肺癌和胃癌，女性仅次于乳腺癌和子宫颈癌，其病死率居恶性肿瘤死因的第二位[1-2]。虽然目前有包括手术、化疗、基因、中医等治疗手段，但仍需寻找新的治疗途径。

NMDA受体是一种谷氨酸离子型受体，以NR1为其组成的必需亚基，此受体在神经系统突触形成、突触可塑性改变等方面具有较强调节作用，并在精神分裂症、癫痫等疾病中也发挥着重要作用。近年来，研究[3-5]发现NMDA受体(NMDAR)不仅在神经系统发育中有着重要作用，其还参与消化道肿瘤细胞的增殖、分化及胃肠运动，被认为是一种脑肠肽。研究[6-7]表明，NMDA受体1(NMDAR1)拮抗剂能抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞周期阻滞及细胞的死亡，有望成为肿瘤细胞抑制药物。本实验通过观察NMDAR1抑制剂MK801对人结肠癌裸鼠移植瘤生长的影响，并用免疫组织化学法(免疫组化法)检测移植瘤中NMDAR1的表达情况，为临床上结肠癌的治疗提供新途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

BALB/c-nu裸鼠，6～8周龄，雌性，体重16～18 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004。HT-29人结肠癌细胞株由山东省医学科学院实验室提供。

1.2 药物与试剂

MK801购自MCE公司；胎牛血清购自HyClone公司；McCoy’s 5A培养基购于Genom公司；0.25%胰蛋白酶购自Solarbio公司；一抗NMDAR1抗体及其他免疫组织化学试剂、苏木精-伊红染色试剂均购自济南柠檬生物技术有限公司。

1.3 仪器

独立送回风净化笼具购于苏州市苏杭科技器材有限公司；5%CO2恒温孵箱购自Thermo公司；洁净动物柜购自北京文慧净化设备厂；低温高速离心机购于Sigma公司；倒置光学显微镜购于日本尼康公司；超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；超低温冰箱购自Thermo Forma公司。

1.4 细胞培养及传代

在无菌细胞培养室超净工作台中完成以下操作步骤：将人结肠癌细胞株HT-29置于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养传代，取生长状态良好的指数生长期细胞进行实验。

1.5 收集细胞及小鼠造模

将处于指数生长期细胞用胰酶消化成细胞悬液，予以无菌生理盐水稀释，调整细胞浓度为5.0×106个/ml，每只裸鼠右上肢腋下皮肤消毒后，将该细胞悬液0.2 ml注射于皮下，建立HT-29结肠癌裸鼠移植瘤模型。

1.6 分组及治疗

模型制备成功后，将裸鼠随机分为实验组和对照组，每组12只。实验组给予MK801 0.6 mg/(kg·d)腹腔注射给药，对照组给予腹腔注射等量生理盐水。记录肿瘤生长状况，每隔2天测量肿瘤的短径a(mm)和长径b(mm)，根据Steel公式：V=a×b2/2，计算肿瘤体积。给药4周后处死裸鼠并称取瘤重。采用免疫组化法检测2组肿瘤组织中NMDAR1的表达变化。

1.7 免疫组化检测肿瘤组织NMDAR1的表达

将肿瘤组织用4%多聚甲醛固定后脱水、透明、浸蜡、包埋，制成4 μm厚的切片，切片用5%BSA封闭1 h，然后加入一抗NMDAR1抗体，4 ℃孵育过夜，洗涤，加入二抗,37 ℃孵育30 min，DAB显色，光学显微镜下观察，并对所有组织切片进行拍照，然后使用软件Image-Pro Plus 6.0对NMDAR1的表达进行定量测量，即平均光密度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 MK801对裸鼠移植瘤生长的影响

治疗后，与对照组相比，实验组对人结肠癌裸鼠移植瘤具有明显抑制作用，对照组和实验组肿瘤体积分别为(2 178.00±164.40) mm3和(1 326.00±87.68) mm3，肿瘤质量分别为(3.53±0.13) g和(1.45±0.13) g，2组肿瘤体积和质量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。MK801可减缓人结肠癌裸鼠移植瘤的生长，缩小肿瘤体积，抑瘤率为58.87%。见图1、表1。

A：对照组；B：实验组图1 人结肠癌裸鼠移植瘤图

组别肿瘤体积(mm3)肿瘤质量(g)抑瘤率(%)对照组2178.00±164.403.53±0.13-实验组1326.00±87.68△1.45±0.13△58.87△

与对照组比较△P<0.05

2.2 MK801对NMDAR1表达的影响

治疗后，实验组NMDAR1的表达较对照组显著降低。对照组和实验组肿瘤组织中NMDAR1平均光密度值分别为(1.54±0.03)和(0.41±0.03)，实验组NMDAR1平均光密度值明显小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表2。

A：对照组；B：实验组图2 人结肠癌裸鼠移植瘤NMDAR1表达(苏木精-伊红染色，光镜×20，×40)

组别平均光密度对照组1.54±0.03实验组0.41±0.03△

与对照组比较△P<0.05

3 讨论

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统内最重要的兴奋性神经递质，其受体主要分为离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体[8]。其中NMDA受体为主要的离子型受体，由NR1、NR2和NR3等亚基组成。NR1是该受体的功能部分，为其组成的必需亚基，在突触可塑性、神经毒性方面有着重要的生理功能，并在精神分裂症、情绪障碍、癫痫等疾病的发生中也发挥着显著作用[9-11]。近年来，人们对NMDA受体的研究不仅局限于神经系统，Stepulak等[12]研究发现NMDA受体不仅在神经细胞中表达，在肿瘤细胞中也有表达。Watanabe等[13]研究证实，胃癌中存在NMDA受体的表达，并且NMDA受体抑制剂可以抑制肿瘤细胞的生长。也有研究[5，14]表明，肝癌、胰腺癌等肿瘤细胞中NMDA受体表达上调，应用NMDA受体拮抗剂可抑制肿瘤细胞增殖、迁移，并能诱导细胞周期的阻滞。有文献[15]发现结肠癌细胞中存在NMDA受体的表达，故本文以此为靶向，研究NMDAR1抑制剂MK801对人结肠癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。

本实验选择人结肠癌HT-29细胞株在裸鼠皮下接种，制备裸鼠移植瘤模型，建模成功率为100%。给药后结果表明，NMDAR1抑制剂对人结肠癌裸鼠移植瘤具有明显抑制作用，可减缓人结肠癌裸鼠移植瘤的生长，缩小肿瘤体积，明显降低NMDAR1的表达，提示MK801通过下调NMDAR1的表达抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长。

NMDAR1抑制剂MK801抑制结肠癌的信号通路机制至今尚未明确，但有研究[16]证实Ca2+可以刺激肿瘤的生长，影响肿瘤细胞的迁移。肿瘤细胞相对较低的静息膜电位(-30～50 mV)可有较高的概率通过NMDA受体使Ca2+内流，刺激肿瘤增殖。并有研究[17]表明没有Ca2+在细胞外介质中的NMDA受体拮抗剂的抗增殖作用明显减弱。后期可以从Ca2+方面着手，研究NMDA受体拮抗剂抗肿瘤的信号通路机制，以便为以后的抗肿瘤药物提供更具体的实验依据。

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ExperimentalStudyofMK801inInhibitingHumanColonCancerXenograftinNudeMiceLI Xue1，GUO Yuting2△

1ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Ji’nan250355，China

2TheSecondAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Ji’nan250001，China

ObjectiveTo study the inhibitory effect of NMDA receptor1(NMDAR1) inhibitor MK801 on the growth of human colon cancer xenografts in nude mice and its mechanism.MethodsThe nude mice model of human colon cancer HT-29 cell line was established and divided into experimental group and control group.The experimental group was given MK801 0.6 mg/(kg·d) intraperitoneally for 4 weeks.At the same time，the control group was given intraperitoneal injection of equal volume of normal saline.The expression of NMDAR1 was detected using immunohistochemistry in both two groups.ResultsAfter 4 weeks of intervention，the tumor volume in the experimental group was significantly smaller than that in the control group(P<0.05).Compared with the control group，the expression of NMDAR1 in tumor tissue in experimental group decreased significantly(P<0.01).ConclusionNMDAR1 inhibitor MK801 can inhibit the growth of human colon cancer xenograft in nude mice through inhibiting the expression of NMDAR1.

NMDA receptor1 inhibitor；MK801；colon cancer；nude mice；xenograft

2017-03-28)