基于原子转移自由基聚合反应的高灵敏度ELISA方法研究

常向前,王得顺,张爱红,徐力红,林虹君

1.武警天津市总队医院 检验科，天津 300171；2.防化学院，北京 102205；3.空军防化大队，北京 102206

基于原子转移自由基聚合反应的高灵敏度ELISA方法研究

常向前1,王得顺1,张爱红2,徐力红3,林虹君3

1.武警天津市总队医院 检验科，天津 300171；2.防化学院，北京 102205；3.空军防化大队，北京 102206

目的：对传统酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行优化改进，以提高其检测灵敏度，拓展应用范围。方法：通过在传统ELISA方法中引入原子转移自由基聚合反应（ATRP）和纳米金颗粒（GNPs），并将大量辣根过氧化物酶（HRP）与二抗结合，提高了HRP与抗原的结合比例，进而实现了对待检测物的信号放大。结果：优化后的ELISA方法在对β淀粉样蛋白的检测中，检测限（LOD）降低为原来的1/81。结论：改进后的ELISA方法性能稳定，灵敏度大幅提高，能够用于对痕量目标检测物的检测。

原子转移自由基聚合反应；纳米金；酶联免疫检测

1971年瑞典学者[1]和荷兰学者[2]分别报道了将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA方法是利用抗原、抗体两者在化学结构和空间构型上呈现的互补关系对待测物进行检测，因此该方法具有高度的特异性。此外，该方法还可实现在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上进行定量。因此，酶联免疫法是目前在痕量生物标志物、目标蛋白质检测中使用最广的方法之一[3-5]。

尽管ELISA方法具有灵敏度高、重复性好、使用方便等优点，但随着科研和实际应用要求的不断提高，其在疾病早期预防、超痕量目标物检测中仍不能满足要求[6-10]。鉴于目前ELISA方法存在的局限性，我们通过引入原子转移自由基聚合（atom transfer radical polymer，ATRP）反应和纳米金颗粒（gold nanoparticles，GNPs）载体对其进行改进，建立了一种自组装的信号放大方法。即，通过ATRP反应在纳米金表面引入大量活性支链，再将大量辣根过氧化物酶（horseradish peroxi⁃dase，HRP）连接到支链上，进而提高了HRP和待测抗原的比例，明显放大了检测信号，大大提高了检测灵敏度，降低了检测限，拓展了该方法的应用范围和领域。

1 材料与方法

1.1 材料

血清（含β淀粉样蛋白）来自北京大学肿瘤医院）；β淀粉样蛋白一抗（Aβ-Ab1）、HRP标记的二抗（HRP-Ab2）均购自Abcam公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma-Aldrich公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）购自南京市威圣化工贸易有限公司；柠檬酸钠购自上海创顺化工有限公司；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20 均购自北京化学试剂公司；实验用水为二次蒸馏水。

Tecnai G2 20型透射电镜（FEI香港有限公司）；85-2数显型恒温搅拌器（国瑞试验仪器厂）；Milli-Q型纯水仪（≥18 MΩ，Millipore公司）；Sor⁃vall Legend Micro 17 Centrifuge（Thermo公司）。

1.2 引发剂的制备

将0.3g 11-巯基-1-十一烷醇溶于6mL四氢呋喃（提供反应的液体环境）中，再加入108μL吡啶（催化剂），混合后通入氮气除氧，同时冰浴30min，之后缓慢滴加164μL 2-溴异丁酰溴，并持续搅拌4h（持续通氮气），最后将反应后的溶液用滤纸过滤，用氮气吹干至略黏稠，得到引发剂，充氮气后密闭于4℃保存。

1.3 ATRP修饰反应

将制备的纳米金置于含500μL反应液（引发剂）的EP管中，将EP管置于旋转混合仪上过夜反应，用甲醇清洗掉剩余引发剂后，加入ATRP反应液（2 mol/L GMA，0.02 mol/L CuCl，0.03 mol/L N,N,N',N'',N''-五甲基二乙烯三胺，0.001 mol/L CuCl2，环己醇），再加入0.03 mol/L葡萄糖，常温振摇反应24h。

1.3.1 环氧基团的开环反应 配制体积分数为50％的异丙醇水溶液，并以其为溶剂配制体积分数为60％的乙二胺溶液。将修饰有高密度环氧基团的纳米金置于上述乙二胺溶液中（80℃）反应4h，使氨基暴露。

1.3.2 修饰醛基官能团 称量67.84g磷酸氢二钠和1.65g磷酸二氢钠，溶于2 L去离子水中，配制成PBS溶液。以PBS溶液为溶剂，配制体积分数为40％的戊二醛溶液。将1.3.1中获得的暴露氨基的纳米金置于戊二醛溶液中（10～30℃）反应12h，即在纳米金表面修饰上了醛基。

1.3.3 在纳米金表面进行抗体和HRP的固定用PBS溶液配制终浓度为2 mg/mL的一抗和HRP溶液（pH8.0），并加入氰基硼氢化钠使其终浓度为5 mg/mL，混合均匀后作为反应液。将1.3.2中获得的表面修饰上醛基的纳米金置于该反应液中，4℃反应24h后用50mmol/L Tris-HCl缓冲液（50mmol/L Tris溶液用HCl调至pH8）清洗。

1.3.4 聚合物侧链剩余醛基的封闭 向PBS溶液中加入氨基乙醇至其体积分数为1％，将1.3.3中的纳米金放入其中，4℃反应4～12h。反应完成后用50mmol/L Tris-HCl缓冲液（配方同1.3.3中所述）清洗3次，于4℃保存，即获得上述基于ATRP修饰的纳米金-抗体结合物。

1.4 纳米金的制备

将1mL 1％的氯金酸溶液加入100mL双蒸水中，用力搅拌并加热至沸腾，迅速加入4.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，充分搅拌，保持沸腾10min。这期间溶液颜色由灰变蓝再变紫，最后为酒红色。移去热源，再搅拌15min，自然冷却至室温，即制得平均粒径为16nm的纳米金胶体，4℃保存备用。其透射电镜图见图1。

为了得到分散均匀、大小匀称的纳米金颗粒，首先将所用器皿用王水（浓HCl∶浓HNO3=3∶1）充分浸泡，然后用双蒸水冲洗，烘干待用。因为此步骤需要绝对清洁的器皿，任何杂质都会使制备的纳米金颗粒团聚。

2 结果与讨论

2.1 将纳米金、抗体结合物用于ELISA检测

对新建立的方法进行性能测试，具体步骤如下：①将GST蛋白包被在96孔板上，于4℃过夜，次日弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，每次3min；②加入按一定比例稀释的制备一抗于上述已包被的反应孔中，37℃孵育1h，然后洗涤；同时以正常一抗做对照，并用空白孔做假阳性对照；③于各反应孔中加入临时配置的TMB底物溶液 0.1mL，37℃孵育 10～30min；④用 2 mol/L 硫酸终止反应；⑤用酶标仪检测D450nm值。

2.2 改进后的ELISA方法评价

以β淀粉样蛋白为样品，对改进的ELISA方法进行性能评价。β淀粉样蛋白不仅与神经元的退行性病变有关，而且还可以激活一系列病例事件，包括星型胶质细胞和小胶质细胞的激活、血脑屏障的破坏和微循环的变化等，是阿尔茨海默病患者脑内老年斑周围神经元变性和死亡的主要原因。

改进的ELISA法检测β淀粉样蛋白的具体步骤如下：①将β淀粉样蛋白抗原固定在96孔板上；②用BSA进行封闭；③加入一抗，让其与抗原充分结合；④洗去未结合的多余一抗；⑤加入制备好的二抗；⑥加入酶底物，检测读数。

在传统ELISA方法中，每一个抗原蛋白质只能结合一个对应一抗，而每个一抗也只能结合一个二抗和一个HRP；而在改进的ELISA方法中，通过结合在ATRP支链上的纳米金载体的放大作用，最终可与多个HRP结合，能够将较小的检测信号放大，提高了检测的灵敏度。其原理见图2。

为了进一步考察新方法的性能，设计了如下实验。如图3，将配置好的待测样品平均分成2份，从左至右依次按1/3的比例稀释。a行采用改进的方法进行检测，b行采用传统ELISA法。从结果来看，改进的方法可以对前8个点（a行中A～H）进行有效检测，而改进前则只能对前4个点（b行中A～D）进行有效检测，即改进的方法检测限降低为原来的1/81。多次重复实验结果表明，改进的方法性能稳定，重复性好，可用于对样本中低浓度蛋白质进行灵敏检测。

2.3 结论

通过ATRP反应将纳米金引入传统ELISA方法，大大提高了HRP与抗原的结合比例，对检测信号进行了放大，提高了方法的灵敏度，检测限降低为传统方法的1/81，进一步拓展了该检测方法的应用领域。而且改进的ELISA方法重复性好，性能稳定。可以预见，新方法将会在蛋白质检测和诊断学研究中发挥重要作用。

图2 改进的ELISA方法信号放大示意图

图3 改进后（a）和改进前（b）的ELISA方法对β淀粉样蛋白的检测结果

[1] Orden D E V.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） quantitative assay ofimmunoglobulin G[J].Immunochemistry,1971,8:871-874.

[2]Weemen B K V,Schuurs A H W M.Immunoassay us⁃ing antigen-enzyme conjugates[J].FEBS Lett,1971,15:232-236.

[3] Wu Y F,Xue P,Kang Y,et al.Paper-based microflu⁃idic electrochemical immunodevice integrated with nanobioprobes onto graphene film for ultrasensitive multiplexed detection ofcancer biomarkers[J].Anal Chem,2013,85（18）:8661-8668.

[4] Du D,Wang L M,Shao Y Y,et al.Functionalized graphene oxide as a nanocarrier in a multienzyme la⁃beling amplification strategy for ultrasensitive electro⁃chemicalimmunoassayofphosphorylated p53（S392）[J].Anal Chem,2011,83（3）:746-752.

[5] Sia S K,Linder V,Parviz B A,et al.An integrated approach to a portable and low cost immunoassay for resource-poor settings[J].Angew Chem,2004,116:504-508.

[6] Dixit C K,VashistS K,O'Neill F T,et al.Develop⁃ment of a high sensitivity rapid sandwich ELISA pro⁃cedure and its comparison with the conventional ap⁃proach[J].Anal Chem,2010,82:7049-7052.

[7] Du D,Zou Z X,Shin Y,et al.Sensitive immunosen⁃sor for cancer biomarker based on dual signal amplifi⁃cation strategy ofgraphene sheetsand multienzyme functionalized carbon nanospheres[J].Anal Chem,2010,82:2989-2995.

[8] Qin D L,He X X,Wang K M,et al.Fluorescent nanoparticle-based indirect immunofluorescence micros⁃copy for detection of Mycobacterium tuberculosis[J].J Biomed Biotechnol,2007,2007（7）:89364.

[9] Pris A D,Mondello F J,Wroczynski R J,et al.Im⁃proved specific biodetection with ion trap mobility spectrometry（ITMS）:a 10-min,multiplexed,immuno⁃magnetic ELISA[J].Anal Chem,2009,81:9948-9954.

[10]Hayashi Y,Matsuda R,Maitani T,et al.Precision,limit of detection and range of quantitation in competi⁃tive ELISA[J].Anal Chem,2004,76:1295-1301.

High Sensitivity ELISA Method Research Based on Atom Radical Polymerization Reaction

CHANG Xiang-Qian1,WANG De-Shun1,ZHANG Ai-Hong2*,XU Li-Hong3,LIN Hong-Jun3
1.Department of Clinical Laboratory,Tianjin General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces,Tian⁃jin 300171;2.Institute of Chemical Defense,Beijing 102205;3.Air Force Defense Union,Beijing 102206;China
*Corresponding author,E-mail:hjlhappy7858@163.com

Objective:To improve the traditional enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） strategy for increas⁃ing its sensitivity and extending the application.Methods:A large amount of horseradish peroxidase（HRP） was in⁃troduced to secondary antibody by introducing atom transfer radical polymer（ATRP） reaction and gold nanoparticles（GNPs）.The modification improved the binding ratio of HRP to secondary antibody,achieved the object of detec⁃tion signal amplification,and improved the traditional detection sensitivity greatly.Results:Limit of detection（LOD） after improvement decreased to 1/81 of that in traditional ELISA method.Conclusion:The newly built ELISA method had good stability,excellent sensitivity,and was able to detect ultralow-abundancy analytes.

atom transfer radical polymer;gold nanoparticles;enzyme-linked immunosorbent assay

R392.1

A

1009-0002（2017）04-0534-04

更正声明

应第一作者张传朋要求，本刊2016年第27卷第6期804～807页刊发的论文《肠出血性大肠杆菌O157∶H7前噬菌体CP-933Y缺失突变株的构建》，通信作者应为王慧（E-mail：geno0109@vip.sina.com）。

《生物技术通讯》杂志社

2017-01-24

天津市科技计划（14ZCDZSY00033）；天津市应用基础与前沿技术研究计划（14JCQNJC12600）；武警后勤学院附属医院种子基金（FYM201514）

常向前（1982- ），男，研究生学历，（E-mail）changxq13820668062@163.com

通信作者：张爱红，（E-mail）hjlhappy7858@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.026

特此声明。