EH-L-Fc在CHO细胞中的表达、纯化及活性分析

庞玉红，刘玉斌，于爱平，吕英涛

1.青岛科技大学，山东 青岛 266042；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850

EH-L-Fc在CHO细胞中的表达、纯化及活性分析

庞玉红1，刘玉斌2，于爱平2，吕英涛1

1.青岛科技大学，山东 青岛 266042；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850

目的：为延长重组新蛭素（EH）的半衰期，制备通过连接肽连接的重组新蛭素与IgG1 Fc的融合蛋白EH-LFc，并对其进行功能分析。方法：采用重叠PCR技术构建Eh-L-Fc融合基因，克隆至表达载体pcDNA3.1，用脂质体将重组表达载体转染至中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中，G418抗性筛选稳定克隆株；Western印迹检测培养上清中EH-LFc蛋白的表达，用有限稀释法对G418抗性筛选出的混合克隆单克隆化，通过Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白，Lowry法检测蛋白浓度，SDS-PAGE、HPLC法检测目的蛋白纯度，质谱法分析相对分子质量，凝血因子Ⅹa裂解融合蛋白后采用纤维蛋白凝块法测定其抗凝活性。结果：构建了重组表达载体pcDNA3.1-Eh-L-Fc，并获得稳定表达EHL-Fc的细胞株。表达产物的相对分子质量为72 168，HPLC检测亲和层析获得的EH-L-Fc纯度达93.9％。完整的EH-L-Fc无抗凝活性，经凝血因子Ⅹa裂解后其抗凝比活性为96.6 ATU/mg。结论：获得稳定表达EH-L-Fc的CHO细胞株和较高纯度的重组融合蛋白，且该重组融合蛋白经凝血因子Ⅹa裂解后可释放抗凝活性。EH-L-Fc融合蛋白的获得为研究新蛭素的长效剂型奠定了重要基础。

新蛭素；抗凝；Fc融合蛋白

水蛭素（hirudin，HV）是水蛭唾液腺分泌的一种酸性多肽，是目前已知的最强有力的凝血酶天然抑制剂[1-2]，有良好的抗凝血和抗血栓作用[3]。虽然水蛭素不会引起血小板减少症，且不依赖抗凝血酶Ⅲ，但其同样存在出血副作用[4]，这极大地限制了它的广泛应用。本实验室前期构建表达了能靶向血栓释放抗凝活性的水蛭素衍生物——新蛭素（neorudin，EH）[5]，它是在水蛭素N端连接能够被凝血因子Ⅹa（FⅩa）和Ⅺa（FⅪa）识别并切割的短肽谷氨酸-脯氨酸-精氨酸（EPR），该短肽可以封闭水蛭素的抗凝活性。当体内发生血栓或凝血系统被激活时，该短肽可被富集于血栓局部的FⅩa和FⅪa识别并切割，释放出有活性的水蛭素，从而发挥抗栓作用。通过这种作用机制，使EH能够靶向作用于血栓局部，从而降低全身的出血副作用。然而，EH是一条短肽，其相对分子质量只有7300，很容易被肾小球过滤，经尿液排出，这就使得EH在体内的血浆半衰期较短，只有1～2h，临床上需要多次滴注给药。因此，如何延长EH半衰期，减少给药次数，提高患者的生活质量，成为一个有价值的课题。

将蛋白药物与免疫球蛋白Fc段融合构建融合蛋白，是延长蛋白药物半衰期的一种重要方法。Fc融合蛋白主要通过2种方式延长目的蛋白的半衰期：通过提高相对分子质量，减少肾小球过滤；Fc融合蛋白与Fc新生受体（neonatal Fc re⁃ceptor，FcRn）结合，通过FcRn介导的胞吞转运循环模型延缓融合蛋白被蛋白酶降解[6-8]。在本研究中，我们将EH与人IgG1的Fc融合，用刚性连接肽（linker）将EH蛋白和Fc结构域连接，通过增加2个蛋白间的空间距离[9]而减少蛋白间的相互影响，以期在不影响EH抗凝功能的前提下，延长其血浆半衰期。

1 材料与方法

1.1 材料

CHO细胞由本实验室保存；大肠杆菌感受态细胞DH5α购自北京康为世纪生物科技有限公司；携带Eh（204bp）片段的pUCK-Eh由上海生工公司合成；携带Fc（669bp）片段的pET-22a-V、pcDNA3.1由本实验室保存；山羊抗人IgG-Fc（HRP）购自Abcam公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；FⅩa、限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ为NEB公司产品；KOD-Plus-Neo购自Toyobo公司；LipofectAMINE 3000 Reagent Proto⁃col购自Invitrogen公司；Opti-MEM、DMEM-F12培养基购自Gibco公司；酵母粉和蛋白胨购自默克公司；优级胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；Protein A亲和层析预装柱购自Thermo公司；牛纤维蛋白原、人凝血酶购自中国食品药品检定研究院。

1.2 重组表达载体pcDNA3.1-Eh-L-Fc的构建

为确保EH-L-Fc融合蛋白分泌到培养基中，在Eh-L-Fc融合基因的5'端融合一段分泌信号肽（SP）序列，5'引物为 SP-FP。分别以 EH-FP、Fc-FP为正向引物，EH-RP、Fc-RP为反向引物，原核表达载体pUCK-Eh、pET-22a-Fc为模板进行PCR扩增Eh、Fc（反应条件：94℃预变性2min，98℃变性 10s，68℃退火/延伸 30s，30个循环，延伸 7min）；以SP-FP为正向引物、EH-RP为反向引物、Eh为模板，PCR扩增Eh（反应条件：68℃退火30s，68℃延伸30s，扩增30个循环）；以SP-FP为正向引物，linker-RP为反向引物，Eh、Linker为模板，连接扩增Eh-Linker（反应条件：68℃退火/延伸30s，30个循环）；最后以SP-FP为正向引物，Fc-RP为反向引物，Eh-Linker、Fc为模板，连接扩增Eh-L-Fc（反应条件：68℃退火/延伸 30s，30个循环）。重叠PCR流程见图1，引物信息见表1。

PCR产物Eh-L-Fc与质粒pcDNA3.1分别经HindⅢ、XhoⅠ双酶切后，用T4DNA连接酶连接，42℃热激，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性单克隆于LB培养基中，过夜培养后离心取菌体，提取质粒，用HindⅢ、XhoⅠ双酶切鉴定重组载体后，测序鉴定。

1.3 瞬时转染验证重组质粒在CHO细胞中的表达

1.3.1 前期细胞预处理 转染前一天，取对数生长期的CHO细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，离心重悬后接种于6孔细胞培养板，每孔2×105个细胞，于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中过夜培养，细胞培养基为DMEM/F12+10％胎牛血清，当贴壁细胞汇合度达70％～90％时，将细胞培养基更换无血清Opti-MEM培养基。

1.3.2 转染 取3.75μL LipfectAMINE 3000加入125μL Opti-MEM 培养基中；取 5μg重组质粒加入250μL Opti-MEM培养基中，再加入10μL P3000 Reagent混匀；按1∶1的比例混合上述2种溶液，室温静置5min，将质粒混合液分别按标记加入6孔细胞培养板中，转染6h后，更换含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。

1.3.3 转录水平和翻译水平验证蛋白表达 转染24h后，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，提取RNA，RT-PCR获得cDNA；以SP-FP为正向引物、Fc-RP为反向引物、RT-PCR获得的cDNA为模板，68℃退火/延伸30s，30个循环；转染48h后，收集培养基，用0.25％胰酶消化收集细胞，提取胞内蛋白。将收集到的培养基与提取的胞内蛋白进行SDS-PAGE后，转印至PVDF膜，用5％脱脂牛奶封闭，孵育二抗（1∶5000）后，发光试剂显影。

图1 重叠PCR扩增Eh-L-Fc融合基因流程图

1.4 稳定高表达细胞株的筛选

将瞬时转染得到的培养24h的细胞用0.25％胰蛋白酶消化转至100mm培养皿中，培养液为DMEM/F12+10％胎牛血清，加入终浓度为800μg/mL的G418进行抗性筛选，以转染空载体和未转染组为对照。14d后挑取细胞克隆于24孔板中扩增，有限稀释法将细胞稀释至100/mL后再依次梯度稀释铺入96孔板培养，待细胞长满后依次转入24孔板、6孔板、100mm培养皿扩大培养。

1.5 融合蛋白的表达与纯化

将筛选到的稳定转染单克隆细胞株培养2d后收集培养上清，用0.22μm滤膜过滤，Protein A-Agarose亲和层析柱纯化，用pH7.2、0.15 mol/L NaCl、100mmol/L的磷酸盐缓冲液平衡柱子，pH3.0、0.1 mol/L的甘氨酸缓冲液洗脱蛋白，pH8.5的1 mol/L Tris-HCl中和洗脱蛋白液至pH7.4。

1.6 纯化蛋白的浓度与纯度检测

采用Lowry法检测纯化后融合蛋白的浓度[10]；采用SDS-PAGE灰度分析法与反向高效液相色谱法（RP-HPLC）检测纯化后融合蛋白的纯度（HPLC条件：C18柱子，A相为水，B相为乙腈，A、B相中分别加入1‰三氟乙酸，5％～70％浓度乙腈线性洗脱，检测波长280nm，流速1mL/min，上样量1μg）。

表1 实验所用引物和连接肽的序列

1.7 融合蛋白相对分子质量测定

采用还原SDS-PAGE法与基质辅助激光解吸飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）检测融合蛋白的相对分子质量。

1.8 体外活性检测

牛源FⅩa（1 mg/mL）37℃裂解融合蛋白6h，取 10μL 裂解产物，加入20μL 8 IU/mL 的凝血酶，轻轻混匀后再加入20μL 5 mg/mL的纤维蛋白原，轻弹混匀，室温静置15min，轻弹管壁，观察凝块形成情况。以同体积去离子水代替裂解的EH-L-Fc溶液和凝血酶溶液，其他条件不变作为空白对照；以同体积去离子水代替裂解的EHL-Fc溶液，其他条件不变作为阳性对照；以未经裂解的EH-L-Fc溶液代替裂解的EH-L-Fc溶液，其他条件不变作为裂解前对照。用下式计算抗凝比活性：

其中，8 IU/mL为凝血酶活性单位，V凝血酶为凝血酶体积，CEH-L-Fc为 EH-L-Fc浓度，VEH-L-Fc为 EH-LFc溶液体积。

2 结果

2.1 重组表达载体的构建及验证

采用瑞士模型工作区（Swiss-Model Work⁃space）对设计的融合蛋白空间结构进行预测，预测结构如图2A，显示刚性连接肽通过形成3个α螺旋连接EH和Fc，使得2个结构域不存在空间位阻，提示Fc不会影响EH功能，即可以按照图2B所绘的重组表达质粒图谱进行后续重组质粒构建实验。

利用前述方法和引物，经SOE-PCR扩增融合目的基因Eh-L-Fc（990bp），将获得的产物片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增条带约1000bp，与理论值相符（图3A）。将获得的重组融合基因Eh-L-Fc克隆至表达载体pcDNA3.1并转化大肠杆菌感受态DH5α，提取质粒进行HindⅢ、XhoⅠ双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切获得1000bp左右的条带，与重组融合基因Eh-L-Fc理论大小相符（图3B）。核苷酸测序结果也显示，重组融合基因未发生碱基或核苷酸序列突变，说明我们获得了正确的重组表达载体pcDNA3.1-Eh-L-Fc。

2.2 转录水平检测融合基因的表达

将转染重组表达载体pcDNA3.1-Eh-L-Fc获得的瞬转CHO细胞系和转染空载体的CHO细胞系提取RNA，经试剂盒反转录获得cDNA，以获得的cDNA为模板，SP-FP和Fc-RP为引物进行PCR，将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示pcDNA3.1-Eh-L-Fc瞬转CHO细胞系在1000bp左右有目的核苷酸片段存在，而转染空载体的CHO系在相同位置未见任何条带（图4），说明重组表达载体成功转入CHO细胞。

图2 EH-L-Fc融合蛋白空间结构预测图谱及质粒构建图谱

2.3 翻译水平检测融合蛋白的表达情况

为检测重组蛋白在转染重组质粒pcDNA3.1-Eh-L-Fc的CHO细胞和经过抗性筛选、克隆化的CHO细胞中的表达，采用山羊抗人IgG-Fc（HRP）抗体对分泌到细胞培养基中的目的蛋白和CHO胞内蛋白进行检测，图5A显示转染后的CHO细胞表达EH-L-Fc融合蛋白，且为分泌表达（图5B），图5C显示不同阳性细胞克隆表达量不同。

2.4 EH-L-Fc蛋白的纯化及检测

用ProteinA-Agarose亲和层析柱纯化pcDNA3.1-Eh-L-Fc高表达的CHO细胞系培养上清中的EH-L-Fc蛋白，亲和层析图谱见图6，层析洗脱峰的SDS-PAGE结果见图7，电泳结果均显示只有1条蛋白带。经Lowry法测得纯化后蛋白浓度为0.66 mg/mL，经扫描灰度分析，层析产物纯度为90.96％，HPLC结果显示层析产物纯度为93.9％（图8），质谱显示EH-L-Fc的相对分子质量为72 168（图9）。综上可知，获得了较高纯度的重组融合蛋白EH-L-Fc。

图3 重组质粒pcDNA3.1-Eh-L-Fc的构建过程核酸电泳图

图4 瞬染CHO细胞系中RT-PCR检测pcDNA3.1-Eh-L-Fc的表达

图5 Western印迹检测EH-L-Fc融合蛋白的表达

2.5 EH-L-Fc生物活性检测

用纤维蛋白凝块法测定EH-L-Fc蛋白活性，结果见表2。未裂解的EH-L-Fc融合蛋白和阳性对照均有凝块形成，即无抗凝活性，表明EH-LFc融合蛋白本身无抗凝活性，只有经FⅩa裂解后才具有抗凝活性。按照前述体外活性检测中提及的抗凝比活性计算公式，计算得抗凝活性为96.6 ATU/mg。

图6 pcDNA3.1-Eh-L-Fc高表达的CHO细胞系培养基的Protein A亲和层析图谱

图7 亲和层析产物的SDS-PAGE

图8 亲和层析产物的HPLC检测

图9 EH-L-Fc的质谱检测

表2 EH-L-Fc的抗凝比活性

3 讨论

血栓形成和血栓栓塞2种病理过程所引起的疾病，临床上称为血栓性疾病，目前是人类死亡的最主要原因之一，病死率居高不下。血栓一旦形成往往造成不可逆的后果，因此血栓性疾病的治疗以预防为主。目前，不管是临床上常用的肝素类、华法令类抗凝药，还是新上市的凝血酶抑制剂、FⅩa抑制剂等抗栓药物，都存在出血副作用[11]，因此降低出血副作用成为抗凝药物研发的重要方向。

水蛭素能与游离的或与纤维蛋白原结合的凝血酶以1∶1结合，形成紧密的非共价可逆性化合物，进而抑制凝血酶的活性。自1986年水蛭素cDNA被克隆后[12]，经过30年的研究和应用，重组水蛭素取得巨大成就，并在真核、原核多种载体中获得表达[13]。为解决水蛭素的出血副作用问题，本实验室前期构建表达了新蛭素，在体内外证明[14]完整的新蛭素没有抗凝血酶活性，经FⅩa切割后可以释放水蛭素的抗凝活性[14]，大鼠颈动脉血栓模型和大鼠后腔静脉血栓模型实验结果显示，动物给予EH后血栓形成时间明显延长，血栓质量显著减小，同时对凝血参数影响较弱，动物出血时间、凝血酶原时间和凝血酶时间明显低于阳性对照药水蛭素[15]。因而，体内外实验结果均表明，EH能够在发挥抗凝活性的前提下，降低出血副作用。

EH相对分子质量为7300，远小于肾小球过滤拦截的70 000的分子大小，因而易被肾小球过滤，经尿液排出，从而导致其体内半衰期较短。本实验室前期实验结果也显示，EH在实验动物体内主要以原型形式经尿液排泄，消除半衰期只有1个多小时。因而，EH在临床上须一天2次静脉滴注给药，静滴时间较长，影响患者的生活质量，这就使得延长EH的半衰期势在必行。

以往，延长半衰期主要通过结合线性或支链的聚乙二醇（PEG）[16-17]来增加相对分子质量和流体半径。虽然PEG已被美国FDA批准为安全分子（general recognized as safe，GRAS），但依然存在一些问题，如在肾外皮管上皮细胞形成空泡、在体内不被降解、价格昂贵、与蛋白间化学结合后需要再纯化结合物等，因此许多研究者也在努力寻求更安全价优的取代物。另一种提高药代动力学参数的方法为糖基化，以此降低降解，延长半衰期[18]。利用融合蛋白提高多肽和小分子蛋白的药代动力学参数被广泛应用，最常用的融合活性蛋白或多肽为白蛋白、人免疫球蛋白IgG的Fc片段和没有结构的多聚肽链，如XTEN，目前有43种融合蛋白处于Ⅱ、Ⅲ期临床阶段，其中20种被确认可以延长目的蛋白的半衰期[18]。

Fc融合蛋白的理念在1980年代首次提出，1998年，第一个Fc融合蛋白依那西普（etanercept）获准上市。至2015年5月，11种不同类型的Fc融合蛋白被美国FDA批准上市。其中，2014年上市的 Eloctate、Alprolix、Trulicity的半衰期分别从 12h、18h、1～2min提高到 19h、83h、3.75d[17]。因此，利用Fc与目的蛋白融合来延长半衰期不仅具有研究价值，更有市场价值。

本实验将EH与Fc进行融合，把Fc设计在EH的下游，保证EH的N端EPR充分暴露，可以被FⅩa和FⅪa识别并裂解，从而保留其抗凝活性的靶向性释放。EH与Fc之间采用一段刚性α螺旋连接肽（AEAAAKEAAAKEAAAKA），以此降低EH和Fc分子间的相互影响。

我们通过瞬时转染，初步确定了重组蛋白能在CHO细胞里表达，筛选了稳定表达的单克隆细胞株，培养上清经亲和层析获得了纯度较高的融合蛋白。单链融合蛋白EH-L-Fc理论相对分子质量为33 880，我们获得的融合蛋白经质谱分析，其相对分子质量为72 168，说明EH-L-Fc以二聚体形式存在，但表达产物的分子比二聚体理论分子量大，其原因可能是融合蛋白发生了糖基化，这有待后续实验验证。本实验结果显示完整的EH-L-Fc蛋白的确无抗凝活性，但经FⅩa酶切后可释放其抗凝活性，其抗凝比活性为96.6 ATU/mg，EH抗凝活性为512 ATU/mg，该抗凝比活性换算成摩尔分子抗凝活性时，与EH的摩尔分子抗凝活性（数据）相当，说明与Fc融合后，EH的生物特性基本没有受到影响。

本实验结果表明，通过CHO表达系统可以获得保留EH生物特性的EH-L-Fc融合蛋白，初步显示了EH-L-Fc融合蛋白的成药可能性。后续工作将继续改进完善纯化工艺，并验证融合蛋白在体内延长半衰期的效果。

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Expression,Purification and Function Analysis of EH-L-Fc Fusion Protein

PANG Yu-Hong1,LIU Yu-Bin2,YU Ai-Ping2*,LYU Ying-Tao1*
1.Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042;2.Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;China
*Co-corresponding authors,LYU Ying-Tao,E-mail:ytlv@sina.com;YU Ai-Ping,E-mail:yuap117@163.com

Objective:To prolong the half-life of recombinant neorudin（EH）,a new form of recombinant neoru⁃din（EH-L-Fc） was constructed by fusion of the neorudin gene and the coding sequence for fragment of human IgG1 with a rigid linker peptide,and the function of EH-L-Fc was analyzed.Methods:The fusion gene was ob⁃tained by SOE-PCR,and constructed into expression vector pcDNA3.1.The recombinant pcDNA3.1-Eh-L-Fc was transfected into CHO cells by liposomes.Stable gene expression cell lines were selected by geneticin（G418） resis⁃tance screening.The expression of EH-L-Fc protein in the cell culture supernatant was measured by Western blot⁃ting.The monoclone was selected from the resistance screening polyclone by limiting dilution analysis.The fusion protein was purified by Protein A affinity chromatography,and then the purity of the EH-L-Fc protein was ana⁃lyzed by SDS-PAGE and RP-HPLC.The fusion protein was cleaved by coagulation factorⅩa and the anticoagu⁃lant activity was determined in vitro by fibrin clot method.Results:The results showed that the recombinant ex⁃pression vector pcDNA3.1-Eh-L-Fc was successfully constructed,and the stable cell clone CHO-pcDNA3.1-Eh-LFc was obtained.The expression product is a dimer with a molecular weight of 72 168 Da.The purity of the re⁃combinant protein was 93.9％with a 96.9 ATU/mg anticoagulant specific activity after cleaved by factorⅩa.The complete recombinant EH-L-Fc has no anticoagulant activity.Conclusion:The stable CHO cell line harboring the recombinant Eh-L-Fc was successfully obtained.The EH-L-Fc fusion protein with a high purity and bioactivity af⁃ter cleavage by factorⅩa provides an important foundation for the further research of long acting EH-L-Fc.

neorudin;anticoagulant;Fc-fusion protein

Q78

A

1009-0002（2017）04-0422-07

2017-02-10

国家科技重大专项“重大新药创制”（2012ZX09102301-008）

庞玉红（1991- ），女，硕士研究生，（E-mail）15201048952@163.com

于爱平，（E-mail）yuap117@163.com；吕英涛，（E-mail）ytlv@sina.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.004