流式细胞术下ARH对比LRH对早期宫颈癌患者外周血及腹腔液中Th1/Th2细胞因子的影响

李秀芳 林丽红 黄相艳

流式细胞术下ARH对比LRH对早期宫颈癌患者外周血及腹腔液中Th1/Th2细胞因子的影响

李秀芳 林丽红 黄相艳

目的探讨腹腔镜宫颈癌根治术(laparoscopic radical hysterectomy，LRH)以及开腹宫颈癌根治术(abdominal radical hysterectomy，ARH)对早期宫颈癌患者机体的局部以及免疫系统的影响。方法选取早期(Ⅰa2～Ⅱa1)宫颈癌患者210例，分LRH组(行腔镜手术)118例，ARH组(行腹式手术)92例。分别在术前1天、术后1天、术后3天抽取观察组和对照组患者肘部静脉血10 ml，在术中(在开腹后或者腹腔镜进入腹部后立刻抽取腹腔冲洗液)、术后1天、术后3天抽取患者腹腔液5 ml，利用流式细胞术检测腹腔液中和外周血TH1/TH2细胞因子，比较LRH组和ARH组术前术后免疫状态的变化。结果术后第1天ARH组TNF-α水平上升，然而LRH组变化不明显；术后第3天ARH组表达水平继续上升，LRH组变化不大，两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。术后1天2组的TH1/TH2比值均下降，与术前1天相比相对降低，组间差异具有统计学意义(P<0.05)；术后1月，2组患者TH1/TH2比值恢复术前水平。ARH组术后1天至术后3天IL-6水平比术中升高(P<0.05)，而LRH组升高程度较小(P<0.05)。结论腔镜下宫颈癌根治术与开腹宫颈癌根治术相比对于全身的免疫系统干扰更小，并且创伤更小，恢复更迅速，可以广泛应用于宫颈癌的临床治疗。

腹膜免疫；子宫颈癌；腹腔镜宫颈癌根治术；TH1/TH2细胞因子

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1527～1530)

随着医疗技术的快速发展，腹腔镜手术在癌症的治疗领域得到了广泛应用。比起开腹手术，腔镜手术对患者的免疫系统影响更小，术后并发症少，住院时间短，并且其具有创伤小、术口更加美观等优势，因此备受广大患者及医务者的青睐[1-3]。流式细胞术是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时测得一个细胞的多个参数，具有准确性好、精度高、速度快的优点[4-5]。本研究通过流式细胞术来检测腹腔宫颈癌根治术及开腹宫颈癌根治术的术前术后血液中和腹腔液中Th1/Th2细胞因子含量，探究腹腔镜与开腹宫颈癌根治术对患者免疫系统和术后恢复的影响，为早期宫颈癌患者术式的选择和预后判断提供可靠的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在我院2011年7月至2016年2月间治疗的早期(Ⅰa2～Ⅱa1)宫颈癌患者210例。根据手术方式分为LRH组(腔镜手术)118例，ARH组(腹式手术)92例。2组实验对象手术时均全身麻醉，手术过程中都补充充分血容量，术中、术后未输血。ARH组患者平均年龄(42.7±8.1)岁，体重指数(24.1±3.1)kg/m2；鳞癌80例，腺癌12例；Ⅰa2期0例，Ⅰb1期84例，Ⅰb2期4例，Ⅰa1期4例。LRH组患者平均年龄(41.3±6.4)岁，体重指数(23.5±2.5)kg/m2；鳞癌102例，腺癌16例；Ⅰa2期6例，Ⅰb1期108例，Ⅰb2期4例。本研究获我院伦理委员会批准，患者或近亲属对研究方案签署知情同意书。

1.2 实验病例选择标准

纳入标准：都为原发性肿瘤且确诊为宫颈癌；全部患者手术前均经过胸片和全身的淋巴结、盆、腹腔的B超检查；手术前排除其他的内外科合并症；术后不接受免疫增强的治疗；后续的系统治疗都在我院进行。排除标准：除宫颈癌外患有其他癌症；患者具有自身免疫病或重大免疫缺陷；患者不同意参与此次研究。

1.3 试剂和主要仪器

试剂：Cytometric Bead Array(CBA)(美国BD公司生产)；仪器：流式细胞仪FACSCalibur(美国BD公司)、超净工作台(Forma)、超低温冰箱(Forma)、低温高速离心机(Hemeus)及Lml吸头(Asygen)。

1.4 方法

1.4.1 检测方法 试剂：①BD Cytometric Bead Array Huaman Th1/Th2 Cytokine Kit Ⅱ，以此鉴别细胞因子的免疫表形。②PBS.PH保持在7.2～7.4。外周血和腹腔液的收集 ：主要是收集实验组与对照组患者术后1天、3天的空腹外周血5 ml，收集后加0.8 ml ACD抗凝剂，充分混合，保存在冰盒中送至实验室。在腹腔中取腹腔积液2 ml，整个过程迅速流畅，术后1天及3天从引流管取液2 ml，收取后送至实验室分离，取上清液，于-30 ℃的冰箱中冷藏。

1.4.2 实验步骤 检测血液中Th1/Th2：取2 ml血液，1∶1的比例与PBS混合稀释，取3 ml复温后的人淋巴细胞分离液，放入离心管中，稀释后的血液4 ml铺在分离液之上，将1 500 rpm离心半小时，取中间白色层，加入PBS 2 ml后，离心10 min，取上清液，加入300 μl DMEM培养基，取100 μl放入离心管中，使用DMEM培养基稀释；37 ℃下，5%CO2在培养箱中孵育5 h左右，将100 μl液体放入离心管中，加入2.5 μl CD8-TC和10 μl CD-3APC，避光室温条件下孵育15 min，加入3 ml PBS，1 500 rpn离心5 min，除去上清液，用移液器混匀少许剩余液体；混合均匀的液体避光15 min，加入3 ml PBS，1 500 rpn离心5 min，除去上清液，用0.5 ml PBS重悬后，上机。

1.4.3 检测腹腔液中Th1/Th2细胞因子 Th1和Th2细胞对机体的特异性免疫和非特异性免疫都有重要的调节作用，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，促进B细胞产生抗体，Th1细胞在机体抗胞内病毒感染中具有重要作用。当机体受到异己抗原攻击时，会出现Th1或Th2细胞群功能升高，该现象即为Th1/Th2漂移。从冰箱中取出之前收集的标本，在37 ℃环境下解冻，准备洁净的流式管，标准品和腹腔液样本，分别加入50 μl混合捕获微球，向标准品中加入50 μl的人炎症因子稀释液，样本管中加入50 μl腹腔液标本，在室温、避光条件下孵育1.5 h，加入1 ml洗涤缓冲剂，然后离心5 min，除去上清液，留下100 μl左右液体进行检测。

1.5 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件对实验所得的数据进行处理和分析，组间数据对比采用t检验和卡方检验，P<0.05视为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ARH和LHR术中和术后情况比较

ARH组手术用时与LRH组比较，差异无统计学差异(P>0.05)；ARH组术中出血量比较多，并且通气时间比较长，组间差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组术后情况比较

2.2 ARH组和LRH组术中、术后1天腹腔液中TNF-α表达水平的变化和比较

术后第1天ARH组TNF-α水平上升(P<0.05)，然而LRH组变化不明显；术后第3天ARH组表达水平继续上升，LRH组变化不大，见表2。

表2 2组术后TNF-α表达水平比较

2.3 2组腹腔液里TH1/TH2比值水平变化

术后1天2组的TH1/TH2比值均下降，与术前1天相比相对降低，组间差异具有统计学意义(P<0.05)；术后1月，2组患者TH1/TH2比值恢复到术前水平，见表3。

表3 2组腹腔液TH1/TH2比值水平变化

2.4 ARH组和LRH组术中、术后1天、术后3天腹腔液IL-6表达水平的变化情况

ARH组术后1天至术后3天IL-6水平比术中显著升高(P<0.05)，而LRH组升高程度较小(P<0.05)，见表4。

表4 ARH组和LRH组术中、术后1天、术后3天IL-6表达水平的变化情况

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，近年来其发病率有上升趋势。随着宫颈细胞学筛查的普遍应用，宫颈癌能够在早期被发现并进行治疗[6-8]。腹腔镜手术技术的出现，对患者机体免疫系统的影响将进一步大幅度降低，在今后必将成为主流手术方式。流式细胞术在国内外宫颈癌患者的治疗中发挥着重要作用，目前已被广泛应用于宫颈癌的临床治疗，治疗疗效得到了众多患者的认可[9-11]。

本次研究通过观察2种不同手术方式对腹腔液中TH1/TH2细胞因子影响情况，在术中不同时间段的研究表明，术后第1天ARH组TNF-α水平上升，然而LRH组变化不明显；术后第3天ARH组表达水平继续上升，LRH组变化不大，两组间差异具有统计学意义。术后1天2组的TH1/TH2比值均下降，与术前1天相比相对降低，ARH组降低程度更大，提示行ARH手术方案的患者创伤更大，组间差异具有统计学意义，术后1月，两组患者TH1/TH2比值恢复术前水平。ARH组术后1天至术后3天IL-6水平比术中升高(P<0.05)，而LRH组升高程度较小。Th1和Th2细胞对机体的特异性免疫和非特异性免疫都有重要的调节作用，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，促进B细胞产生抗体，Th1细胞在机体抗胞内病毒感染中具有重要作用。当机体受到异己抗原攻击时，会出现Th1或Th2细胞群功能升高，该现象即为Th1/Th2漂移。出现上述结果的主要原因是腔镜式手术创伤程度更小，而创伤程度恰恰是外科类手术对细胞免疫的影响因素。手术损伤会造成Th1、Th2平衡进一步破环，手术创伤口越大，平衡越向Th2偏移，由此说明开腹比腔镜对细胞免疫的抑制更严重。

综上所述，腔镜下宫颈癌根治术与开腹宫颈癌根治术相比对于全身的免疫系统干扰更小，并且创伤更小，恢复更迅速，可以广泛应用于宫颈癌的临床治疗。

[1] 郎景和.子宫颈癌预防的现代策略〔C〕.第十一届全国子宫颈癌前期病变、子宫颈癌热点研讨会暨子宫肿瘤高峰论坛论文集,2014：1-5.

[2] Lin Q，Aihara A，Chung W，et al.LRH1 promotes pancreatic cancer metastasis〔J〕.Cancer Lett，2014，350(12)：15-24.

[3] Qiushi L，Arihiro A，Waihong C，et al.LRH1 as a driving factor in pancreatic cancer growth〔J〕.Cancer Lett，2014，345(1)：85-90.

[4] Bianco S，Brunelle M，Jangal M，et al.LRH-1 governs vital transcriptional programs in endocrine-sensitive and -resistant breast cancer cells〔J〕.Cancer Res，2014，74(7)：2015-2025.

[5] Bayrer JR，Mukkamala S，Sablin EP，et al.Silencing LRH-1 in colon cancer cell lines impairs proliferation and alters gene expression programs〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112(8)：2467-2472.

[6] Mamrosh JL，Lee JM，Wagner M，et al.Nuclear receptor LRH-1/NR5A2 is required and targetable for liver endoplasmic reticulum stress resolution〔J〕.Elife，2014，3(8)：1-24.

[7] Suzawa M，Miranda DA，Ramos KA，et al.A gene-expression screen identifies a non-toxic sumoylation inhibitor that Mimics SUMO-less human LRH-1 in liver〔J〕.Elife，2015，4(14)：254-259.

[8] 万 安，周 颖，曲皖君，等.子宫颈癌中vimentin和ki-67蛋白表达及其影响因素分析〔J〕.中华疾病控制杂志，2014，18(9)：805-807.

[9] 袁 卓.腹腔镜下子宫颈癌根治术治疗早期宫颈癌的疗效分析〔J〕.中国医药指南，2014，12(33)：171 .

[10] Wang W，Shang C，Huang J，et al.Long-term oncological outcomes after laparoscopic versus abdominal radical hysterectomy in stage Ⅰa2～ Ⅱa2 cervical cancer： a matched cohort study〔J〕.Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2015，50(12)：894-901.

[11] Yang L，Yang P，Li D，et al.Comparison of safety and efficacy of laparoscopic versus abdominal radical hysterectomy in the treatment of patients with stage Ⅰa2～ Ⅱb cervical cancer〔J〕.Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2015，50(12)：915-922.

(编辑：甘艳)

FlowCytometryunderARHContrastLRHEarlyCervicalCancerinPeripheralBloodandPeritonealLiquidTh1/Th2CellFactor

LIXiufang，LINLihong，HUANGXiangyan.

AnyangTumorHospital，Anyang，455000

ObjectiveTo study the effect of laparoscopic radical hysterectomy(LRH) and abdominal radical hysterectomy (ARH) on patients’ immune system.Methods210 cases of (Ⅰa2～Ⅱa1) patients with early cervical cancer were divided into the observation group and the control group， the experimental group

LRH (118 cases) and the control group received ARH(92 cases ).Respectively 1 day before surgery，1 day，3 days after extraction of the 2 groups elbow venous blood 10 ml，during surgery (laparotomy or laparoscopy after extraction into the abdomen immediately peritoneal fluid)，after 1 day，3 days after extracting 5ml peritoneal fluid of patients using flow cytometry before change in peritoneal fluid and peripheral blood of TH1/TH2 cytokines，the experimental group and control group postoperative immune status.ResultsAfter first days,the level of TNF-α in ARH group increased, but the change of LRH group was not obvious. The expression level of ARH Group continued to rise third days after operation, and the change of LRH group was not big. The difference between two groups was statistically significant (P<0.05). 1 days after operation, the ratio of TH1/TH2 in the 2 groups decreased, compared with the 1 day before operation, the difference was statistically significant (P<0.05), and in January, the ratio of TH1/TH2 in the two groups was restored to the preoperative level. In the ARH group, the IL-6 level increased 1 days after operation and 3 days after operation (P<0.05), while the LRH group was less elevated (P<0.05).ConclusionCompared with open radical cervical surgery,laparoscopic radical surgery for cervical cancer has less interference to the systemic immune system,less trauma and quicker recovery.It can be widely used in the clinical treatment of cervical cancer.

Immunized intraperitoneally；Cervical cancer；Laparoscopic radical hysterectomy(LRH)；TH1/TH2 cytokines

455000 河南省安阳市肿瘤医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.039

R737.33

A

1001-5930(2017)09-1527-04

2016-09-23

2017-03-09)