双氢青蒿素对UVB诱导的人皮肤HaCaT细胞凋亡的保护作用

惠海英 白静静 孙晶莹 刘 杨 肖生祥

·论著·

陕西省中医药管理局(编号：2015lc039)

陕西省社会发展科技攻关项目(编号：2016sf-156)

1陕西省人民医院，陕西西安，710068

2西安交通大学第二医院，陕西西安，710004

惠海英，E-mail: haiyinghui@163.com

双氢青蒿素对UVB诱导的人皮肤HaCaT细胞凋亡的保护作用

惠海英1白静静1孙晶莹1刘 杨1肖生祥2

目的明确双氢青蒿素(DHA)对UVB诱导人皮肤HaCaT细胞凋亡的保护作用。方法将体外培养的HaCaT细胞分为空白对照组，UVB 照射组和UVB+DHA(20、40、60、80 μmol/L)组，采用 MTT法检测细胞系的增殖情况，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，RT-PCR法检测抗凋亡基因survivin和促凋亡基因caspease-3(激活型)mRNA水平，Western检测相关蛋白表达水平。结果30 mJ/cm2UVB照射24 h后，UVB组和UVB+DHA(20、40、60、80 μmol/L)组细胞的增殖率分别为空白对照组的(50.13±2.42)%，(60.23±2.30)%,(69.24±3.19)%,(79.37±2.47)%和(70.41±2.24)%。UVB组和UVB+60 μmol/L DHA组中HaCaT细胞凋亡率分别为(46.7±3.2)%和(23.71±1.2)%。与UVB组比较，UVB+60 μmol/L DHA组中HaCaT细胞caspase-3 mRNA及蛋白表达降低、survivin mRNA及蛋白表达升高。结论DHA可抑制UVB所致HaCaT细胞的凋亡，其机制可能与survivin和caspase-3有关。

双氢青蒿素； HaCaT细胞； caspease-3; UVB

近年来，紫外线对人体的损伤已引起人们的广泛关注，资料表明日光中的紫外线特别是中波紫外线(ultraviolet B, UVB)与皮肤的光老化、光损伤和光致癌的发生密切相关，严重威胁着人类的身体健康[1,2]。因此开发紫外线防护药物尤为重要。现代药理研究发现青蒿中含有多种药用成分具有抗菌、抗寄生虫、解热抗炎以及免疫抑制等作用，且毒性极低，无毒副作用。很多学者将青蒿素及其衍生物用于光敏性皮肤病的治疗[3-6]，取得了较好的疗效，但机制尚不清楚。双氢青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)是青蒿素类药物在体内的主要活性代谢产物。本研究通过UVB诱导HaCaT细胞损伤，建立UVB损伤皮肤细胞模型，通过观察细胞增殖活性及凋亡情况，检测凋亡抑制蛋白survivin和凋亡蛋白caspase-3的表达水平，探讨DHA对UVB导致HaCaT细胞损伤的拮抗作用，为开发新型抗皮肤损伤产品提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料及药物、仪器

1.1.1.1 细胞 永生化人角质形成细胞株(HaCaT细胞)为第四军医大学西京医院皮肤科李承新教授馈赠。

1.1.1.2 药物 DHA(分子式C15H24O5, 分子量284.35 kd)购于西安昊轩生物技术有限公司，纯度98%。

1.1.1.3 试剂 RPMI 1640液、胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco公司)，噻唑兰(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(美国sigma公司)。Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)。survivin、caspase-3兔多克隆抗体和β-actin以及相应的二级抗体(美国SANTA公司)。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(日本Takara公司)。PCR引物由北京华大生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.1.4 仪器 电泳仪(美国Bio-RAD公司)、 酶标仪(美国Bio-Tek公司)、电转槽(美国Bio-RAD公司)、流式细胞仪(美国BD-FACScalibur)、7500型实时定量PCR检测仪(美国 ABI公司)、SS-03B型光疗仪(上海sigma公司，波长311 nm)

1.2 方法

1.2.1 HaCaT细胞株培养 接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5% CO2的培养箱中培养，80%汇合后胰蛋白酶消化法传代培养，于传代后第2天换液。取对数生长期细胞制成4×104个/mL单细胞悬液，接种于6孔板后继续培养24 h给药。

1.2.2 中波紫外线照射 待细胞生长至每孔融合80%～90%时,吸去培养基,加入2 mL Phosphate Buffer Solution(PBS)缓冲液,对照组用锡箔纸盖住,其余组细胞暴露于UVB灯管下,照射距离约为10 cm，辐射剂量为30 mJ/cm2。紫外线照射后,吸去PBS，并在各孔中重新加入培养液继续常规培养。

“哎呀，傻妹子，怎么就没关系呢。杨连长可是老刀一手带出来的。老刀在河北路上捡到他，那时他还是个大毛孩，一路南征北战出生入死，他们是知根知底的难兄难弟。活到今天，很不容易啊。所以，听句姐的劝，错不了。”向阳花站起身，拉一把田志芳，“回去吧，要不老刀和杨连长等着急了。回家，你自个儿琢磨琢磨姐今天说的话，看有几份道理不？”

1.2.3 药物处理 双氢青蒿素以二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为10-1mol/L储存液(DMSO浓度≤1‰)，-20℃避光保存，用时用DMEM培养液将二氢青蒿素稀释配成20、40、60、80 μmol/L的工作液，加入药物工作液后，细胞继续培养24 h，进行后续实验。

1.2.4 实验分组 将HaCaT细胞分为3组。A 组:空白对照组,不加DHA，不照射UVB;B组:UVB照射组,不加DHA;C组:DHA组即照射UVB并给予一定浓度(20、40、60、80 μmol/L DHA)。

1.2.5 HaCaT细胞细胞形态学观察 将HaCaT细胞消化后调整细胞密度为4.0×104个/mL，以每孔1 mL接种于6孔细胞培养板中培养，照射UVB后(除空白对照组)，分别加入含双氢青蒿素0、20、40、60、80 μmol/L的培养液2 mL，培养24 h，倒置显微镜下观察细胞形态变化。

1.2.6 MTT法检测HaCaT细胞增殖率 取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，调整细胞数为4.0×104个/mL，以每孔100 μL接种于96孔培养板，培养24 h后去原培养液进行实验。对照组及处理组各100 μL，每个浓度设3个复孔，于37℃、5% CO2条件下培养。培养结束前4 h，每孔加入MTT(5 ng/mL)20 μL。培养结束时，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪分别测定培养24 h吸光度(A570值)，细胞活性以细胞增殖率表示，细胞增殖率=(处理组平均A值/空白对照组平均A值)×100%。

1.2.7 流式细胞仪Annexin V/PI检测HaCaT细胞早期及中晚期总凋亡率 HaCaT细胞经UVB照射后，加入浓度60 μmol/L DHA工作液培养48 h后，经0.25% Trypsin-EDTA消化，200 g离心6 min，培养液弃去，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，收集的细胞经70%的乙醇 4℃固定2 h，14000 g离心2 min，固定液弃去，PBS缓冲液(含5 mmol/L EDTA)500 μL 进行细胞重悬，再经RNA酶室温孵育 30 min，以1×binding buffer制成单细胞悬液，置于流式管，每组设6个样，加Annexin V-FITC 10 μL与PI 5 μL，混匀后室温下避光孵育15 min，再加入1×binding buffer充分混合后于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

1.2.8 实时定量PCR检测HaCaT细胞caspase-3、survivin mRNA表达 HaCaT细胞经UVB照射后，加入浓度60 μmol/L DHA工作液培养48 h后，吸去培养液，经0.25%胰蛋白酶液分别制成细胞悬液，分别装入离心管，1500 rpm离心，收集细胞，利用TaKaRa细胞总RNA抽提试剂盒提取各组细胞总RNA，采用TaKaRa反转录试剂盒按照说明书以RNA为模板反转录为CDNA，采用荧光定量PCR试剂盒按照说明书以CDNA为模板进行PCR反应，然后使用ABI7500 PCR仪进行荧光PCR。引物由上海华大生物公司合成(表1)。实时定量PCR反应条件：94℃预变性3 min，扩增40个循环，每循环中，94℃变性30 s，57℃退火30 s ，72℃延伸45 s，采集荧光信号；40循环结束后，经94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 45 s，采集熔解曲线。使用7500型Real-time PCR仪分析软件进行数据分析。以β-actin为内参基因，计算同一样本中目的基因与内参基因的含量比值，评价目的基因的表达水平。每个样本取3个复孔，PCR重复3次。

表1 引物序列及产物大小

1.2.9 Western-blot检测细胞caspase-3、survivin蛋白表达 HaCaT细胞经UVB照射后，加入浓度60 μmol/L DHA工作液培养48 h后进行试验，以含0.1% DMSO的培养基为阴性对照组。Western blot检测caspase-3、survivin蛋白表达水平，β-actin作为内参蛋白，按照如下步骤进行操作：进行处理后细胞收集，4℃预冷PBS液洗3次，加入细胞匀浆液(50 mmol/L This-HCl pH=7.4，1% TritonX-100，0.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L EDTA)，4℃、12000 g条件下离心10 min，吸取上清，收集蛋白，收集细胞后用SDS上样缓冲液处理，检测总蛋白浓度，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，上样量(30 μg)，湿转NC膜，用50 g/L脱脂牛奶室温封闭30 min，不同浓度稀释一抗caspase-3(1∶1 000)或survivin(1∶500)孵育 ，4℃过夜，HRP标记抗鼠/兔IgG二抗常温孵育1 h，TBST洗膜，化学发光试剂显色、扫描并进行吸光度分析、计算蛋白相对表达水平。

2 实验结果

2.1 DHA对UVB照射HaCaT细胞形态学影响 倒置显微镜下可见对照组HaCaT细胞生长旺盛，折光率较高，胞体大，形态成梭形或多边形，胞质均匀透明，随培养时间的延长形态无明显变化。UVB照射后的HaCaT细胞增殖减慢，细胞逐渐变小、变圆，折光率减弱，DHA干预后细胞逐渐变大，折光性增高(图1)。

2.2 DHA对UVB照射HaCaT细胞增殖的影响 与对照组相比，30 mJ/cm2UVB照射可使细胞24 h后的增殖率显著下降至对照组的50.13%±2.42%(P<0.05) ;但加入不同浓度的DHA可明显减弱UVB组的作用，其中20 μmol/L DHA可使细胞增殖率恢复至60.23%±2.30%，40 μmol/L时可使细胞增殖率恢复至69.24%±3.19%，60 μmol/L时可使细胞增殖率恢复至79.37%±2.47%，80 μmol/L可使细胞增殖率恢复至70.41%±2.24%，与UVB组相比，有显著差异(P<0.05) 。DHA在4个药物浓度下均表现出一定的防护作用，但未表现出随着质量浓度增加效果增强的效应关系(表2)，可能是由于处于效果平台期所致。在上述药物浓度范围内，药物本身对细胞无损伤作用。DHA具有防护UVB致人HaCaT细胞的作用，即提高了HaCaT细胞在UVB辐射作用下的存活率。

a 对照组;b UVB组;c DHA组

2.3 DHA对UVB照射HaCaT细胞凋亡的影响 根据MTT检测结果我们选定60 μmol/L作为DHA处理药物浓度。HaCaT细胞预处理后用60 μmol/L DHA刺激24 h。结果显示，与对照组比较，UVB组显著增加了HaCaT细胞凋亡，凋亡率增加了(46.7±3.2)%(t=3.78,P<0.05)，而DHA组则降低了UVB组的凋亡率，凋亡率为(23.71±1.2)%(与UVB组比较，t=4.38,P<0.05)。结果表明，DHA可抑制UVB照射所引起的HaCaT细胞凋亡。

2.4 DHA对UVB照射HaCaT细胞caspase-3、survivin mRNA表达的影响 细胞处理24 h后，进行检测，发现与正常对照组相比，UVB组及DHA组HaCaT细胞caspase-3 mRNA表达增加、survivin mRNA表达降低，但UVB组变化更明显(*P<0.05)。同时与UVB组比较，DHA组HaCaT细胞caspase-3 mRNA表达降低，survivin mRNA表达增加(#P<0.05)(图2)。

图2 不同处理组caspase-3、survivin mRNA表达

2.5 DHA对UVB照射HaCaT细胞caspase-3、survivin蛋白表达的影响 细胞处理48 h后，进行检测，发现与正常对照组相比，UVB组survivin蛋白表达降低，caspase-3蛋白表达增强(*P<0.05)。而DHA组明显减弱了UVB对HaCaT细胞的这一作用(#P<0.05)(图3)。

图3 caspase-3、survivin 蛋白表达

3 讨论

自然光中的紫外线辐射是诱发人类皮肤癌的重要环境因素。美国每年约有一百万人被确诊为皮肤癌，皮肤癌也是美国最常见的癌症之一[7]。动物模型试验证明了UV辐射不仅是肿瘤诱发剂而且还是肿瘤促进剂，关于紫外线诱导肿瘤的确切机制仍不清楚，大量研究表明UVB对角质形成细胞的DNA损伤是诱发皮肤肿瘤的基础。由于细胞凋亡与皮肤肿瘤发生的相关性，长期或大量UVB辐射可诱导凋亡相关蛋白的表达。近年来紫外线诱导细胞凋亡尤其是角质形成细胞凋亡引起了人们的关注[8]。

Caspase是执行凋亡的主要酶类，被称为死亡蛋白酶,是细胞凋亡的中枢效应器，细胞凋亡后期的共同途径由caspase激活[9]。Caspase蛋白酶家族在细胞凋亡中的一个重要作用是使保护细胞远离凋亡的各种蛋白失活。Caspase-3处于caspase蛋白酶系的核心地位，在caspase酶系级联反应中发挥重要作用。是细胞凋亡中重要的促凋亡因子。UVB辐射后产生的ROS可促进细胞凋亡，增加细胞内钙离子(Ca2+)，降低线粒体膜电位，激活caspase-3蛋白[10]，最终引起细胞凋亡。

survivin蛋白是新近发现的凋亡抑制蛋白(IAP)家族中新的一员，于1997年被 Ambrosinin在人类基因组库的杂交筛选分离出来，是目前为止所发现的最强的凋亡抑制因子[11]。survivin蛋白具有调控细胞周期和细胞凋亡的双重功能。survivin蛋白广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织，也表达于少数正常成人组织，包括人体皮肤组织。在人体皮肤KSCs及黑素细胞、成纤维细胞均有表达。survivin蛋白在维持人类角质形成细胞周期变化及细胞增殖中起很重要的作用[12]，通过抑制其caspase-3、caspase-7活性而抑制细胞凋亡[13]。

近年来臭氧层破坏严重，照射到地面的紫外线逐年增强,伴随着人口老龄化加速,抵抗皮肤光损伤已成为人们关注的重点，预防和延迟皮肤光老化已成为一个重大的医学问题。中药是拮抗皮肤光损伤的一种有效手段,在改善和防治皮肤光损伤方面具有巨大的潜力。大量天然植物防光研究的结果肯定了中药及提取物对皮肤光损伤的治疗作用。枸杞、绿茶等干预UVB辐射的HaCaT细胞，明显抑制细胞内SOD、GSH-Px下降、降低MDA产生量[14]。黄芪可以减少UVB射线诱发的皮肤上皮细胞IL-6、TNF-α含量，从而减轻UVB对HaCaT细胞的损伤[15]。

近年来,在临床上以青蒿为主的复方用来治疗风湿或类风湿疾病、系统性红斑狼疮、盘形红斑狼疮、皮肤病(湿疹、多形红斑、多形日光疹、夏令水疱病)等,均取得了较好的疗效。有学者认为青蒿素有抑制变态反应性皮炎，抗光感作用[3-6]，这为其光保护作用提供了一定的临床依据。青蒿素及其衍生物有抗疟、抗孕、抗血吸虫、抗纤维化、抗弓形虫、抗心律失常和肿瘤细胞毒性等作用,并具有复杂的免疫调节机制[16]，这为其光保护作用提供了一定的理论依据。

目前研究防治皮肤光损伤的机制主要集中在增强清除自由基能力方面，从细胞凋亡角度进行研究的相关报道较少。DHA是青蒿素类药物在体内的主要活性代谢产物，我们以DHA作为干预药物，以人角质形成细胞HaCaT细胞作为研究对象，研究了DHA对UVB诱导HaCaT细胞凋亡的抑制作用。我们发现，UVB可以抑制HaCaT细胞增殖和活力，诱导细胞凋亡。DHA却减弱了UVB引起的HaCaT细胞增殖抑制作用，但未表现出随着DHA浓度增加效果增强的效应关系，可能是由于处于效果平台期所致。同时我们选取了抑癌基因survivin及促癌基因caspase-3，通过RT-PCR及western-blot检测也观察到30 mJ/cm2的UVB可以降低HaCaT细胞survivin蛋白表达降低,增加caspase-3的表达。而DHA明显减弱了UVB对HaCaT细胞的这一作用。以上结果提示DHA可抑制UVB所致的HaCaT细胞凋亡，具有一定的光保护作用，且该作用可能是通过凋亡相关因子survivin及促癌基因caspase-3来实现。

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ProtectiveeffectofdihydroartemisininonHaCaTcellapoptosisinducedbyUVB

HUIHaiying1,BAIJingjing1,SUNJingying1,LIUYang1,XIAOShengxiang2.

1.ShaanxiProvincialPeople'sHospital,Xi'an710068,China; 2.TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710004,China

HUIHaiying,E-mail:haiyinghui@163.com

Objective: To determine the protective effect of dihydroartemisinin (DHA) on HaCaT cells apoptosis induced by UVB.MethodsHaCaT cells cultured in vitro were divided into blank control group, UVB group and UVB+DHA (20, 40, 60, 80 μmol/L) group. The proliferation of HaCaT cells, cell apoptosis, mRNA levels of anti-apoptotic gene survivin and pro-apoptotic gene caspease-3 and corresponding protein levels were detected by MTT, flow cytometric analysis, qRT-PCR and Western blotting.ResultsAfter the HaCaT cells was irradiated for 24 hs, the proliferation of the cells in the UVB group and UVB+DHA (20, 40, 60, 80 μmol/L) groups was (50.13±2.42)%, (60.23±2.30)%, (69.24±3.19)%, (79.37±2.47)% and (70.41±2.24)% of the blank control group. The apoptosis rate in the UVB group and UVB+60 μmol/L DHA group was (46.7±3.2)% and (23.71±1.2)%. Compared with the UVB group, the mRNA and protein levels of pro-apoptotic gene caspease-3 in the UVB+60 μmol/L DHA group was decreased and the levels of anti-apoptotic gene survivin was increased.ConclusionDHA inhibits the apoptosis of HaCaT cells induced by UVB, which may be related with caspase-3 and survivin.

dihydroartemisinin; HaCaT cells; caspase-3; UVB

(收稿：2017-05-10 修回：2017-06-22)