探讨蛋白酶体功能障碍对散发性帕金森病发病机制的影响

黄优

572000 海南省第三人民医院神经内科

探讨蛋白酶体功能障碍对散发性帕金森病发病机制的影响

黄优

目的探讨蛋白酶体功能障碍对散发性帕金森病的发病机制。方法收集本院2013年7月～2015年7月病例，将存在蛋白酶体功能障碍的帕金森病患者50例作为观察组，未存在蛋白酶体功能障碍的帕金森病患者50例作为对照组，观察2组患者的行为学改变情况，通过RT-PCR、Western blotting分子生物学方法检测患者血液中α-突触核蛋白(α-Syn)表达水平。结果观察组患者血清的α-突触核蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。结论蛋白酶体功能障碍可能导致散发性帕金森病患者血液中α-突触核蛋白(α-Syn)水平升高，考虑该因素可能是散发性帕金森疾病的危险因素。

蛋白酶体功能障碍 α-突触核蛋白(α-Syn) 散发性帕金森 发病机制

帕金森病是一种慢性进展性神经系统疾病，严重损害老年人的身体健康和影响老年人的日常生活，并给家庭和社会带来经济上沉重的负担。在我国中老年人群中发病率已达0.2/100，且呈明显上升趋势[1-2]。临床表现为静止性震颤、动作迟缓、运动减少、肌强直和姿势平衡障碍等4大主要特征，除了特征性的运动障碍等症状以外常伴有精神症状及认知功能障碍，主要表现为抑郁、多疑、思维迟钝、痴呆、智能低下、幻觉等。临床上以平衡障碍一步态异常为主要症状的帕金森病患者往往具有病程进展较快，出现抑郁、认知障碍、跌倒及残疾的概率较高的特点。主要的病理特征是出现黑质的致密部位多巴胺能神经元的选择性丧失，出现残存路易小体，该病包括帕金森病痴呆和路易体痴呆，其中90%的患者呈现散在发生，即散发性的帕金森病[1]。目前该病主要的治疗方法包括药物及外科手术治疗，但是都只是针对临床表现，并不能阻止疾病的进程，该病的致残率较高。该病的病理机制尚未完全明确，可能与遗传及环境因素有关。有研究发现蛋白纤维化是散发性帕金森病患者导致神经元死亡的重要原因[2]。在疾病形成的过程中α-突触核蛋白是与该病最为密切的相关蛋白，具有一定的神经毒性，同时受到脂肪酸的作用，在蛋白酶体功能障碍时会发生结构和构象变化，泛素-蛋白酶体系是细胞蛋白的重要系统，可以参与降解蛋白质和氧化蛋白质[3]。帕金森病患者中黑质致密部位氧化损伤的蛋白水平表达升高。多项研究都表明蛋白酶体可诱导神经细胞凋亡，同时促进胞质内泛素/α-共核蛋白免疫反应阳性包涵体形成[4]。这提示蛋白酶体障碍对神经系统发病起着重要作用，本研究通过探讨蛋白酶体功能障碍对散发性帕金森病发病机制的影响，以期为其在散发性帕金森病发病机制提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、细胞与仪器

逆转录试剂盒(MBI公司，美国)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidas，HRP)标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗小鼠IgG(碧云天生物技术有限公司)，Goat anti-rabbit Ig GHRP，Goat anti-mouse IgG-HRP，α-Syn rabbit polyclonal IgG和β-actin(C4)mouse monoclonal IgG1(购自美国Santa Cruz Biotechnology公司)，避光4 ℃保存。半干式转移和电泳仪(购自美国BIO-RAD公司)。倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)、全能型高性能台式冷冻离心机(Heaeus，BiofugeStratos德国)、深低温冰箱(SANYO，AltraLow日本)、实时定量荧光PCR仪(Rotor-gene3000，澳大利亚)。

1.2 分组

收集本院2013年7月～2015年7月病例，将蛋白酶体功能障碍的帕金森病患者50例作为观察组，其中女22例，男28例，所有的病例都是初治病例，H&Y分期不超过2期，其中1期18例，1.5期15例，2期17例，年龄20～70岁，平均年龄(61.25±10.23)岁。未存在蛋白酶体功能障碍的帕金森病患者50例作为对照组，其中男27例，女23例，年龄0～70岁，平均年龄(64.26±8.56)岁，H&Y分期不超过2期，其中1期18例，1.5期14例，2期18例。抽取患者的空腹血液，匀浆器充分匀浆，之后将其转移至EP管中，以14 000 r/min离心30 min，取上清液移至新EP管保存，使用前经BCA法测定蛋白水平。

1.3 纳入标准

①符合帕金森病的临床诊断标准；②年龄20～70岁；③纳入研究的患者均为接受过多巴胺受体激动剂及左旋多巴制剂的治疗；④入组前头颅影像学检查排除帕金森综合征及多系统萎缩等；⑤依从性强，愿意接受本临床研究。

1.4 排除标准

①年龄<20岁或>70岁的患者；②存在其他躯体系统疾病，有严重其他系统疾病和恶性肿瘤的患者；③帕金森叠加综合征、脑血管病、脑炎、一氧化碳中毒及药物等影响的患者；④患者姿势平衡障碍是由于其他疾病引起的；⑤存在严重的记忆障碍，研究对象的简易智力状态检查MMSE<24分者；⑥不愿意接受本临床研究，依从性差的患者。

1.5 RT-PCR(半定量逆转录聚合酶链反应)

抽取患者的空腹血液，每例血清100mg，提取总RNA。取2μg总RNA行逆转录cDNA，反应体系为20 μl；吸取逆转录产物2 μl，分别加入18sRNA、α-Syn的引物进行PCR反应；反应条件均为95 ℃预变性5 mins，94 ℃变性30 s，60 ℃30 s，72 ℃60 s，72 ℃7 mins，循环30次；PCR产物溴化乙锭1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统下进行观察并拍摄电泳图像；以18sRNA作为内参照，进行PCR产物的半定量分析，测量各电泳条带之吸光度积分值(A值)。

1.6 Western blotting

取血清提取100 mg总蛋白；SDS-PAGE凝胶电泳，半干法转膜，加α-Syn一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶1000)37 ℃孵育1 h；ECL光化学法显色，用彩色图像分析系统测定吸光度。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 α-Syn mRNA表达水平

观察组患者的血清α-突触核蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)(表2)。

表1 α-Syn mRNA表达水平的比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与治疗前比较，△P<0.05

2.2 α-Syn蛋白表达水平

观察组患者的血清α-突触核蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)(表2)。

表2 α-Syn蛋白表达水平的比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与治疗前比较，△P<0.05

3 讨 论

帕金森病是临床上的常见神经退行性疾病，与选择性的中脑黑质致密部位的多巴胺能神经元丢失和退化相关，主要特征是中枢神经系统的变性[5]。最新的研究发现蛋白酶体受到抑制可以导致神经细胞的死亡，形成胞质的泛素-α-共核蛋白免疫反应包涵体使神经元退变，伴随着黑质致密部位多巴胺的丧失，出现神经元的损伤。有研究发现蛋白酶体受损之后多巴胺能神经元会使蛋白酶抑制剂敏感性提高，个别神经细胞出现凋亡，通过选择性损伤机制促使神经细胞的氧自由基的增多，需要蛋白酶体来清除这些受损的蛋白[6-8]。蛋白酶体抑制剂选择性损害多巴胺能神经元可能与α-共核蛋白削弱了突触囊泡对多巴胺的储存，从而进一步增加了胞浆内多巴胺及氧自由基，进而导致细胞氧化受损有关[9-11]。

目前临床尚未明确α-突触核蛋白的正常功能，在多数散发性帕金森病患者中未发现其基因突变，提示α-Syn 可能在散发性帕金森病发病中起着重要作用。泛素蛋白酶体系统是α-Syn的主要降解途径，如果发生障碍则会导致α-Syn 聚集，从而诱发散发性帕金森病的发病[12]。研究发现蛋白酶体成为影响细胞功能的重要药物靶点，该靶点的抑制剂在临床研究中被广泛应用，α-共核蛋白的生理功能尚不清楚，同时散发性帕金森病患者机体内的α-共核蛋白量增高[13-14]。通过多种翻译后修饰形式，引起黑质多巴胺能神经元死亡，中脑黑质内多种细胞、生化及分子改变已被发现，散发性帕金森病患者蛋白酶体α亚单位丢失，蛋白酶体活化因子表达下降，水解功能减弱[15]。大量的研究表明在帕金森病发病机制中蛋白酶体功能下降起重要作用，参与了黑质的神经元内蛋白质聚集及神经元变性[16]。本研究结果显示，观察组α-突触核蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。这提示蛋白酶体功能障碍可能导致患者血清中的α-突触核蛋白(α-Syn)形成，考虑该因素可能是散发性帕金森病的危险因素。蛋白酶体功能不能得到恢复，影响氧化受损的蛋白质的降解，从而降低了蛋白酶体的清除能力，同时氧化受损的蛋白集聚增多，从而造成恶性循环，导致神经元死亡[17]。

综上所述，蛋白酶体功能障碍可能导致α-Syn血液中的聚集释放，也可能是发生散发性帕金森病的重要危险因素。蛋白酶体功能下降可引起多巴胺能神经元内α-共核蛋白聚集，从而导致细胞功能的紊乱，最终促进了多巴胺能神经元的凋亡。

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R742.5

A

1007-0478(2017)05-0455-03

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.019

(2016-09-21收稿)