冬虫夏草与蛹虫草中虫草素和总糖含量测定

孟繁磊，宋志峰，刘笑笑，牛红红，蔡红梅，魏春雁

（吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，吉林长春130033）

冬虫夏草与蛹虫草中虫草素和总糖含量测定

孟繁磊，宋志峰，刘笑笑，牛红红，蔡红梅，魏春雁*

（吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，吉林长春130033）

建立高效液相色谱法测定冬虫夏草与蛹虫草中虫草素含量的方法，比较不同产地冬虫夏草和蛹虫草中虫草素和总糖的含量。以水为溶剂超声波提取、高效液相色谱法测定虫草素含量；苯酚-硫酸法测定总糖含量。结果显示冬虫夏草中没有检出虫草素，而不同产地的蛹虫草中虫草素含量有一定区别，含量分别为1.39%、0.48%、0.11%；总糖含量是蛹虫草高于冬虫夏草，其中不同产地的冬草夏草总糖含量没有差别，而不同产地的蛹虫草总糖含量相差较大，分别为14.69%、20.61%、34.33%。

冬虫夏草；蛹虫草；虫草素；总糖；高效液相色谱法

冬虫夏草（Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc），是寄生于昆虫、少数真菌和植物体上的一类药食两用真菌，与人参、鹿茸并称为三大滋补品，有营养、保健和医疗三重功效，在医疗方面具有免疫调节、内分泌调节、抗癌、抗菌、抗病毒、抗辐射、促造血、护肝、镇静等作用[1]。冬虫夏草资源匮乏、价格高昂，皆因目前尚未实现人工栽培，而其自然环境恶劣，仅分布在青藏高原上的草原和山区，数量十分有限，全靠人力采收，而随着人们经济收入的提高和对养生保健的重视，对其需求量不断增大，价格畸形高涨。蛹虫草（Cordyceps smilitaris（L.ex Fr.）Link），又称北冬虫夏草、北虫草、东北虫草、蛹草等，作为冬虫夏草的同属真菌，具有与冬虫夏草相近甚至相同的化学成分，因此也应具有类似于冬虫夏草的生物功能，人们希望蛹虫草可以作为冬虫夏草的替代品[2]。

由于近年来我国在食品的质量及安全等方面所反映出的问题越来越多，我国对这些方面也给予越来越多的重视，但在《中国药典》[3]一部里也仅以腺苷的含量为指标规定了冬虫夏草的质量标准，但是核苷类的含量受样品采集时间的影响[4]，而且腺苷在其他真菌中也普遍存在，如灵芝[5]，缺乏唯一性和专一性。因此，对虫草中其他较为主要的物质成分虫草素、总糖进行深入研究，并结合产地和外观形状，建立科学的、合理的虫草质量标准迫在眉睫。

目前，虫草素定量测定方法主要有紫外分光光度法[6]、高效液相色谱法[7-10]、毛细管电泳法[11]、高效液相色谱-质谱联用法[12]及薄层色谱扫描法[13]等。本文采用高效液相色谱法测定冬虫夏草与蛹虫草中虫草素含量，建立了准确定量的方法，进行了方法学的验证，并测定了不同产地的冬虫夏草和蛹虫草虫草素和总糖含量，旨在为冬虫夏草及其替代品的质量控制提供基础数据，同时为相关质量标准的建立提供科学依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料

干燥的蛹虫草子实体样品：A（产自吉林省农业科学院）、B（产自吉林农业大学食药用菌基地）、C（产自上海农业科学院食用菌研究所）；干燥的冬虫夏草子实体样品：D（产自西藏那曲）、E（产自青海玉树）。上述样品50℃烘干粉碎，全部过60目筛。

1.2 试剂

虫草素标准品：sigma公司，纯度≥98%；葡萄糖：德国MERCK，纯度≥98%；甲醇（色谱纯）：赛默飞世尔科技公司；浓硫酸（分析纯）、苯酚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器

ACQUITY UPLC H-Class超高液相色谱仪：Waters公司，包括四元溶剂管理器（QSM）、样品管理器（SMFNT）、UV 检测器、EmpowerⅢ色谱管理软件；T6新悦分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-250DB数控超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司；EBA21高速台式离心机：西班牙SELECTA公司。

2 方法

2.1 虫草素检测

2.1.1 色谱条件

色谱柱：C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（体积比为 15∶85）；流速 0.5 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.1.2 虫草素系列标准溶液的制备

准确称取虫草素标样0.100 0 g，超纯水、超声波震荡溶解，定容成1 g/L的标准储备液。分别精密量取储备液 10、50、100、200、500、1 000 μL，置于 10 mL 容量瓶，加超纯水定容至10 mL得到质量浓度为1、5、10、50、100 μg/mL的虫草素系列标准溶液。分别取虫草素系列标准溶液，在2.1.1的色谱条件下，依次进样，以虫草素质量浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行回归分析。

2.1.3 待测液制备

回流法：参考中国药典中关于冬虫夏草测试的样品处理方法，取样品粉末1.00 g，于具塞锥形瓶中，加超纯水100 mL，摇匀，称重，加热回流1 h，放冷，再称重，超纯水补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得待测液。

震荡法：称取样品粉末1.00 g置于具塞的锥形瓶中，准确加超纯水100 mL，盖上塞盖后摇匀，振荡提取1 h，提取完后取1 mL样液离心，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得待测液。

超声法：精密称取样品粉末1.00 g于具塞试管中，加入超纯水100 mL，摇匀，超声提取1 h，每20 min摇匀一次，14 000 r/min离心5 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得待测液。

2.2 可溶性总糖含量的测定

2.2.1 标准曲线的绘制

取适量葡萄糖于105℃烘箱内烘干至质量恒重，称取0.100 4 g加蒸馏水溶解定容至100 mL，即得浓度为1.004 mg/mL的葡萄糖标准储备溶液。精确量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖标准储备液，加水定容至10 mL，摇匀。分别量取上述各溶液2 mL，加入1 mL 5%苯酚试液，再快速加入5 mL浓H2SO4，室温静置5 min，于40℃水浴上加热30 min，取出冷却至室温，于波长490 nm测吸光度值。以吸光度值A为纵坐标，浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线为A=0.009 8×C+0.016 ，r=0.998 9，线性范围 0～100 μg/mL。

2.2.2 样品中总糖含量的测定

准确称取粉碎后的样品0.050 g，放入10 mL刻度离心管中，加4 mL 80%乙醇，超声提取30 min，离心，收集上清液，其残渣加4 mL 80%乙醇重复提取1次，合并上清液。上清液中加入0.010 g活性炭，80℃水浴中脱色30 min，定容至50 mL过滤后取滤液1 mL稀释到10 mL，取2 mL于具塞试管，加入1 mL 5%苯酚试液，再快速加入5 mL浓H2SO4，室温静置5 min，于40℃水浴上加热30 min，取出，冷却至室温。于波长490 nm测吸光度值。

3 结果与分析

3.1 虫草素测定样品前处理条件的确定

3.1.1 提取方法

以蛹虫草A为原料，比较了回流法、振荡法和超声法的提取效率，结果见表1。

表1 不同提取方法对提取效果的影响（n=5）Table 1 Different efficiency of different extraction（n=5）

由表1可以看出，在样品用量、提取时间、提取溶剂使用量都一致的情况下，超声法提取的结果高于回流法和震荡法，确定超声提取法来提取虫草中的虫草素。

3.1.2 超声时间的确定

本试验设定了 30、60、90、120、150 min 5 个不同的超声时间处理，每个重复3次，以蛹虫草A为原料，结果见图1。

图1 超声时间对虫草素的率的影响Fig.1 Effect of extraction time on the yield cordycepin

在0～60 min，虫草素的提取率随超声时间的增加而增加，90、120、150 min的提取率仅分别比60 min的提取率提高了0.28%、0.5%、0.7%，考虑时间成本和耗电成本，确定60 min为虫草素最佳超声提取时间。

3.2 虫草素方法学验证

3.2.1 虫草素标准曲线和最低检出限

分别取虫草素系列标准溶液，在2.1.1的色谱条件下，依次进样，以虫草素质量浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行回归分析。结果表明，虫草素在1 μg/mL～100 μg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为Y=64.424X+37.293（r=0.999 7）。以3倍信噪比为最低检出限，虫草素的检测线为5 mg/kg。图2为虫草素标准品和蛹虫草样品A的色谱图。

3.2.2 精密度试验

把质量浓度为20 μg/mL的虫草素对照品在2.1.1的色谱条件下连续进样6针，测定其峰面积，计算虫草素峰面积的相对标准偏差，结果为3.03%，表明该色谱仪和检测器精密度良好，符合试验的要求。

图2 A虫草素标准溶液（50 μg/mL），B蛹虫草A样品的色谱图Fig.2 A cordycepin standard solution（50 μg/mL），B chromatogram of Cordyceps militaris A sample

3.2.3 稳定性试验

取蛹虫草 A 的供试溶液，分别在 0、2、4、6、8、12、24 h内进样，测定其峰面积，结果虫草素峰面积RSD值为2.37%，表明供试品溶液在24 h是稳定的。

3.2.4 重现性试验

取蛹虫草A样品，称取0.1 g共6份，制备供试品溶液，测定结果虫草素峰面积的RSD值为3.85%，表明样品的重复性良好。

3.2.5 加标回收试验

向已知虫草素含量的蛹虫草A和冬虫夏草D中加入不同量的虫草素标准溶液，使加入的虫草素量约为本底值的0.5、1和2倍，按照2.1.3超声法制备供试溶液，按照2.1.1的色谱条件测定，计算加标回收率，具体结果见表2。

表2 加标回收率测定结果（n=6）Table 2 The determination results of recovery（n=6）

由表2可见，样品的加标回收率在90.00%～99.05%范围内，表明该方法提取测定虫草素的含量准确可行。

3.3 蛹虫草与冬虫夏草中虫草素含量和总糖比较

蛹虫草与冬虫夏草中虫草素和总糖测定结果见表3。

表3 虫草素和总糖含量测定结果Table 3 Determination of cordycepin and total sugar content

表3显示，不同产地的蛹虫草中虫草素含量有一定区别，其中来自于吉林省农科院的蛹虫草A中的虫草素含量显著高于其他两种，这可能与培养蛹虫草所用的菌种、培养条件以及培养基差异有关，也可能与新鲜程度有关，含量达1.39%的样品A为新生产样品，含量为0.48%的样品B为3个月前生产，含量为0.11%的样品C为一年前生产，这一现象，提醒对虫草素稳定性进行研究很有必要，也提醒对生产方式进行研究非常必要。有文献报道[14-15]冬虫夏草中含有一定量的虫草素，但本文用已建立的方法对西藏那曲和新疆玉树产的冬虫夏草进行测定，并未检出虫草素，有可能是以下原因：首先可能是虫草素随冬虫夏草生存环境的变化而有所变化；也可能是本方法的检出限不够低，不能够检测出含量很低的虫草素；也可能是和样品放置时间长短有关。

两个来源的冬虫夏草总糖含量非常接近，但都低于蛹虫草中的总糖含量，这可能和它们的生长环境有关，蛹虫草在生长过程中有足够的碳源来合成碳水化合物，所以总糖含量相对较高；不同产地的蛹虫草总糖含量有一定的差别，可能和培养环境及所用培养基有关。

蛹虫草总糖含量趋势恰恰与虫草素含量趋势相反，呈明显的负相关性（相关系数-0.894 1），两类成分的积累是否拮抗，有待进一步研究。

4 结论

本文建立了利用高效液相色谱测定蛹虫草和冬虫夏草中虫草素含量的方法，此方法结果稳定可靠，是测定虫草样品中虫草素含量的有效方法。

比较了不同产地的冬虫夏草和不同来源的蛹虫草中虫草素和总糖含量，得到以下结论：1）蛹虫草中虫草素含量显著高于冬虫夏草；2）蛹虫草中总糖含量也显著高于冬虫夏草；3）不同来源蛹虫草虫草素和总糖含量差异显著，且有明显的负相关趋势，其机理有待深入研究。

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Determination of Cordycepin and Total Sugar in Cordyceps sinensis and Cordyceps militaris

MENG Fan-lei，SONG Zhi-feng，LIU Xiao-xiao，NIU Hong-hong，CAI Hong-mei，WEI Chun-yan*
（Institute of Agricultural Quality Standard and Testing Technology，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，Jilin，China）

A high performance liquid chromatography（HPLC）method for the determination of cordycepin content in Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis was developed，and the contents of cordycepin and total sugar in both of them with different places of production were compared.Water was used to extract the cordycepin，which was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Then，phenol sulfuric acid method was applied to detect the content of total sugar from Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis.The results showed that no detectable cordycepin in Cordyceps sinensis，and the contents of cordycepin were different because of the different places of origin，they were 1.39%，0.48%，0.11%，respectively.The total sugar content of Cordyceps militaris was higher than that of Cordyceps sinensis，the contents of total sugar of Cordyceps sinensis from different origins were similar，but that of Cordyceps militaris from different origins were different，they were 14.69%，20.61%，34.33%，respectively.

Cordyceps sinensis；Cordyceps militaris；cordycepin；total sugar；high performance liquid chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.028

孟繁磊（1985—），女（汉），助理研究员，硕士研究生，主要从事食品质量安全检测方面的研究。

*通信作者：魏春雁（1962—），女，教授，主要从事食品质量安全检测方面的研究。

2017-03-20