高效液相-示差折光法测定米酒中3种糖的含量

杨成聪，凌霞，胡伟伟，张振东，范文莹，郭壮，*

（1.湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053；2.襄阳市食品药品检验所，湖北襄阳441021）

高效液相-示差折光法测定米酒中3种糖的含量

杨成聪1，凌霞2，胡伟伟1，张振东1，范文莹1，郭壮1，*

（1.湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053；2.襄阳市食品药品检验所，湖北襄阳441021）

建立应用高效液相-示差折光法同时测定米酒中葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量的方法。结果表明当检测器为示差折光检测器，InertSustain NH2氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相中乙腈和水的体积比为 75∶25，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，检测器和色谱柱温度均为35℃时，混标及米酒样品中的3种糖在10 min内均达到基线分离，最低检测限为0.006 g/100 g，精密性试验相对标准偏差值为0.115%、0.045%和0.220%，重复性试验相对标准偏差值为0.670%、0.429%和0.723%，平均回收率为99.65%、100.85%和99.43%。由此可见，高效液相-示差折光法结果准确可靠，适用于米酒中糖的快速分析。

高效液相色谱法；示差折光检测器；米酒；葡萄糖；蔗糖；麦芽糖

米酒又称糯米酒、酒酿或醪糟，是以糯米为主要原料，经酒曲等糖化发酵剂发酵而成，具有酸甜可口、营养丰富等特点[1]。糖类作为米酒的主要物质成分，不仅直接决定了米酒的营养价值，同时通过影响酸甜度亦直接决定了消费者对米酒的喜好程度，因而对米酒中糖的种类和含量进行测定是极为必要的。

目前食品基质中可溶性糖的检测方法主要有苯酚-硫酸法[2]、离子色谱法[3]、毛细管电泳法[4]、气相色谱法[5]和高效液相色谱法[6]等。值得一提的是，目前专门针对米酒的食品安全国家标准尚未发行，参考使用的GB 2758-2012《发酵酒及其配制酒》中亦没有对米酒中糖含量的测定方法进行描述[7]。行业标准[8]或某些地方性标准[9]对米酒中蔗糖或还原糖的测定方法进行了约束，均参照了国家标准GB/T 5009.8-2008《食品中蔗糖的测定》或GB/T 5009.7-2008《食品中还原糖的测定》中的方法，其中GB/T 5009.8-2008指定的是高效液相色谱示差折光检测法（high performance liquid chromatography-refractive index detector，HPLC-RID）或酸水解法，GB/T 5009.7-2008指定的是直接滴定法或高锰酸钾滴定法。值得一提的是，虽然相对于其他方法HPLC-RID存在灵敏度差等缺点，但可以对样品中游离小分子糖进行快速检测[10]。

本研究采用HPLC-RID对米酒中的葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量进行了测定，并对样品前处理及色谱条件进行了优化，实现了米酒中3种糖的快速定量分析，对米酒生产厂家产品的自我检测和相关标准的制定提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米酒：市售；葡萄糖、蔗糖、麦芽糖（均为标准品）：上海金穗生物科技有限公司；乙腈、异丙醇（均为色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸（分析纯）：洛阳化学试剂厂；0.45 μm微孔滤膜：上海半岛实业有限公司净化器材厂。

LC-20ADXR高效液相色谱仪（配置有SIL-20A XR自动进样器、LC-20AD XR四元低压梯度泵、CTO-10AS vp柱温箱、RID-20A示差折光检测器）、Inert－Sustain NH2氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：日本岛津公司；3K15台式高速冷冻离心机：德国Sigma实验室离心机股份有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；KH-100DY超声波清洗机：昆山禾创超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件的优化

1.2.1.1 供试品溶液的制备

分别称取1.000 g经过干燥的葡萄糖、蔗糖和麦芽糖标准品，溶解并定容至同一50 mL容量瓶中，配制成含量为20 mg/mL的3种糖的混合供试溶液。

1.2.1.2 流动相的选择

流动相：分别设置乙腈和水的体积比为85∶15、80 ∶20 和 75 ∶25；进样量：10 μL；检测器：示差折光检测器；色谱柱：InertSustain NH2氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器温度：40℃；色谱柱温度：40℃；流速：1.0 mL/min。

1.2.1.3 检测器和色谱柱温度的选择

检测器温度：分别设置为30、35、40℃；色谱柱温度：同检测器温度；进样量：10 μL；检测器：示差折光检测器；色谱柱：InertSustain NH2氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；流动相：乙腈和水体积比 75∶25。

1.2.1.4 流速的选择

流速：分别设置为 0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min；进样量：10 μL；检测器：示差折光检测器；InertSustain NH2氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈和水体积比75∶25；检测器温度：35℃；色谱柱温：35℃。

1.2.2 米酒中3种糖含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的制备

分别称取2.000 g经过干燥的葡萄糖、蔗糖和麦芽糖标准品，溶解并定容至同一50 mL容量瓶中，配制成含量为40 mg/mL的3种糖的混合标准品贮备溶液。分别吸取 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL 上述混合标准品贮备溶液于10 mL的容量瓶中用超纯水定容，制备分别相当于 0.4、2、4、8、20 mg/mL 的标准品溶液，溶液过0.45 μm的滤膜备用。分别以3种糖的浓度为自变量x，以峰面积为因变量y，采用外标法进行标准曲线计算。

色谱条件为：流速 1.0 mL/min，进样量为 10 μL，检测器为示差折光检测器，色谱柱为InertSustain NH2氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相是体积比为75∶25的乙腈和水混合溶液，检测器和色谱柱温度均为35℃。

1.2.2.2 米酒样品的采集

从襄阳市沃尔玛超市购买7个品牌10个品名的米酒样品，编号依次为XG1-XG10。

1.2.2.3 米酒预处理方式对3种糖含量测定的影响分别按照下述3种方式对米酒样品进行预处理。方法I：米酒样品用超纯水稀释5倍，10 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜后备用。

方法II：2 g米酒样品与1 mL 50%三氯乙酸溶液混合，并用超纯水定容至10 mL，室温放置30 min，10 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜后备用。

方法III：米酒样品用超纯水稀释5倍，10 000 r/min离心10 min，取上清液于121℃热处理15 min后再次10 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜备用。

1.2.2.4 米酒中葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量的测定

所有样品均按照1.2.2.3节中处理I方式进行处理，按照1.2.2.1节色谱条件进行测定。

1.2.3 方法性能研究

1.2.3.1 精密性试验

将1.2.1.1中的供试品溶液，不间断进样7次，分别对葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的峰面积进行测定，同时对其相对标准偏差值（relative standard deviation，RSD）进行计算[11]。色谱条件同1.2.2.1。

1.2.3.2 重复性试验

将XG2样品用超纯水稀释5倍后，10 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜，滤液备用。按照1.2.2.1中的色谱条件进行3种糖峰面积的测定。试验重复7次。

1.2.3.3 加样回收率试验

将XG6样品用超纯水稀释5倍，10 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜，滤液备用。滤液分为4份，1份不做任何处理，另外3份添加一定量的3种糖的混合溶液后在最优的色谱条件下进行测定。色谱条件同1.2.2.1。

1.2.4 统计分析

使用 Matlab 2010b软件（The MathWorks，Natick，MA，USA），采用配对t检验对不同预处理方式样品中3种糖含量的差异性进行分析。使用高效液相色谱工作站自带的LCsolution软件将色谱图另存为数据矩阵后，使用 Origin 8.5软件（OriginLab，MA，USA）作图。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相配比的选择

在InertSustain NH2氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，检测器和色谱柱温度均为40℃的固定条件下，调节乙腈和水体积比分别为85∶15、80∶20和75∶25，流动相构成对3种糖保留时间的影响如图1所示。

图1 流动相构成对3种糖保留时间的影响Fig.1 Effect of mobile phase composition on retention time of 3 kinds of carbohydrate

由图1可知，当乙腈和水体积比为85∶15、80∶20或75∶25时，3种糖均会完全分离开来，然而流动相中乙睛和水的比例对3种糖的保留时间具有明显的影响，其中当乙睛和水的体积比为85∶15时，3种糖的保留时间明显大于体积比为80∶20和75∶25，且选择后2个比例时3种糖的保留时间差异不明显。值得一提的是，当乙睛和水的体积比为80∶20时，3种糖的峰形出现轻微拖尾现象，因而本研究流动相中乙腈和水的体积比最终选定为75∶25。

2.1.2 检测器和色谱柱温度的选择

在InertSustain NH2氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相乙腈和水体积比为 75 ∶25，流速 1.0 mL/min的固定条件下，调节温度分别为30、35、40℃进行试验，检测器和色谱柱温度对3种糖保留时间的影响如图2所示。

由图2可知，当检测器和色谱柱温度均为30℃时，色谱图的基线发生了偏移。当检测器和色谱柱均为35℃和40℃时色谱图基线平稳，且各糖的出峰时间差异不大，因而本研究检测器和色谱柱的温度最终选定为35℃。

图2 检测器和色谱柱温度对3种糖保留时间的影响Fig.2 Effect of detector and column temperature on retention time of 3 kinds of carbohydrate

2.1.3 流速的选择

在InertSustain NH2氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），检测器和色谱柱温度均为35℃，流动相乙腈和水体积比为75∶25的固定条件下，调节流速分别为 0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min进行试验，试验结果如图3所示。

图3 流动相流速对3种糖保留时间的影响Fig.3 Effect of mobile phase flow rate on retention time of 3 kinds of carbohydrate

由图3可知，当流速为0.8 mL/min时，色谱图的基线发生了偏移。当流速为1.0、1.2、1.5 mL/min时色谱图基线平稳，且流速为1.2 mL/min时各糖的出峰时间明显比1.0 mL/min时短，而流速为1.2 mL/min和1.5 mL/min时各糖的出峰时间差异不大。此外，流动相流速越大则柱压亦越大，因而在保证分离度、最大限度的缩短试验时间和不伤害柱子的前提下，本研究流动相的流速最终选定为1.2 mL/min。

2.2 米酒中3种糖含量的测定

2.2.1 标准回归方程

将1.2.1.1节制备得到的不同质量浓度的葡萄糖、蔗糖和麦芽糖标准溶液在1.2.2.1节条件下进行HPLC测定，得到了不同质量浓度的3种糖混合标准品的HPLC图。分别以各糖浓度为自变量x，以峰面积为因变量y进行标准曲线回归方程的计算，结果如表1所示。

表1 葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的回归方程Table 1 Linear regression equations of detection for glucose，sucrose and maltose

由表1可知，3种糖的回归方程的相关系数范围均在0.999以上，由此可见，各糖的浓度和峰面积之间具有良好的线性关系，这也说明本研究所采用的HPLC-RID法可以准确的测定葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量。

2.2.2 米酒预处理方式对3种糖含量测定的影响

选取XG6、XG8和XG10等3个米酒样品，分别采用1.2.2.3中的3种方法进行样品预处理，并按照1.2.2.1节色谱条件进行3种糖含量的测定，其结果如表2所示。

表2 不同预处理方式对米酒中葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量测定的影响（n=3）Table 2 The effect of different pretreatme of rice wine on determination for 3 kinds of carbohydrate（n=3）

由表2可知，采用方法I和II处理的米酒样品经检测发现其葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量差异均不显著（p＞0.05）。由图3亦可知，采用方法III处理的米酒样品经检测发现其蔗糖含量极显著低于其他两种处理方式（p＜0.001），而葡萄糖和麦芽糖差异均不显著（p＞0.05）。值得一提的是，采用方法III进行样品预处理时，米酒样品受热由乳白色变为深黄色，因而本研究中米酒样品预处理方式最终选定为方法I，即样品用超纯水稀释5倍后，10 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜后直接上机测试。

2.2.3 米酒中葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量的测定

样品用超纯水稀释5倍后，10 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜后，利用配备有示差折光检测器的HPLC仪，按照1.3.2.1节的方法对10个米酒样品中葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量进行测定，其结果如表3所示。

表3 HPLC-RID法测定米酒中葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量（n=3）Table 3 Contents of glucose，sucrose and maltose in commercial xiaogan rice wine assayed by HPLC-RID（n=3）

由表3可知，10个米酒样品中只有2个样品检测出了蔗糖，其含量分别为2.25 g/100 g和0.73 g/100 g，所有样品中均检测出了葡萄糖和麦芽糖，其中葡萄糖的含量范围在9.45 g/100 g～30.47 g/100 g，麦芽糖的含量范围在 0.82 g/100 g～4.59 g/100 g。

2.3 方法性能研究

2.3.1 精密性试验结果

精密吸取1.2.1.1节的20 mg/mL的3种糖的混合供试溶液，按1.2.2.1节的色谱条件操作，连续进样7次，分别测量各糖的峰面积，计算葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的RSD，其结果如表4所示。

表4 精密度试验结果Table 4 Results of precision test

由表4可知，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的RSD值分别是0.115%、0.045%和0.220%，由此可见，本研究所采用的HPLC-RID法在测定上述3种糖的含量时具有良好的精密性。

2.3.2 重复性试验结果

称取XG2米酒样品5份，按1.2.3.2节的方法和1.2.2.1节的色谱操作条件，重复进样7次，进行葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量的测定，其结果如表5所示。

表5 重复性试验Table 5 Result of repetitive test

由表5可知，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的RSD值分别是0.670%、0.429%和0.723%，由此可见，本试验重复性良好，可以达到色谱分析的要求。

2.3.3 加样回收率试验结果

称取XG6米酒样品，按1.2.3.3节的方法和1.2.2.1节的色谱操作条件，分别测定不同处理样品中葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量，加样回收率试验结果如表6所示。

表6 加样回收率试验结果Table 6 Results of spike recovery test

由表6可知，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的回收率分别是99.65%、100.85%和99.43%，由此可见，采用HPLC-RID法进行米酒中3种糖含量测定时具有较高的回收率，可以满足色谱定量分析的需求。

3 结论

本研究建立了米酒中葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的测定方法，其中检测器为示差折光检测器，InertSustain NH2氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相中乙腈和水的体积比为75∶25，流速1.0 mL/min，进样量10 uL，检测器和色谱柱温度均为35℃，用该方法对米酒中3种糖的测定具有分离性较好、重复性好、精密度和回收率高等特点。使用该方法研究发现，米酒中葡萄糖的含量为9.45 g/100 g～30.47 g/100 g，麦芽糖的含量为0.82 g/100 g～4.59 g/100 g，而蔗糖仅存在部分样品中，含量分别为2.25 g/100 g和0.73 g/100 g。

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Determination of 3 Kinds of Carbohydrate in Rice Wine by HPLC-RID Method

YANG Cheng-cong1，LING Xia2，HU Wei-wei1，ZHANG Zhen-dong1，FAN Wen-ying1，GUO Zhuang1，*
（1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food，College of Chemical Engineering and Food Science，Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441053，Hubei，China；2.Xiangyang Institute of Food and Drug Supervision，Xiangyang 441021，Hubei，China）

The method for simultaneously determining glucose，sucrose and maltose in rice wine by high performance liquid chromatography-refractive index detector method（HPLC-RID）was established.The separation was carried out on InertSustain NH2amino column（250 mm×4.6 mm，5 μm），mobile phase was acetonitrilewater（75∶25），flow rate was 1.0 mL/min，sample size was 10 μL，and column and detector temperature was 35℃.The glucose，sucrose and maltose were simultaneous separated under the optimized conditions within 10 minutes，the detection limit was 0.006 g/100 g，the results of precision test were 0.115%，0.045%and 0.220%，the relative standard deviation（RSD）of repetitive test were 0.670%，0.429%and 0.723%，and the results of spike recovery test were 99.65%，100.85%and 99.43%.Thus，HPLC-RID with the properties of accurate and reliable，and could be applied for the rapid analysis of carbohydrate in rice wine.

high performance liquid chromatography；refractive index detector；rice wine；glucose；sucrose；maltose

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.026

湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目（T201616）

杨成聪（1996—），男（汉），本科在读，主要从事食品生物技术研究。

*通信作者

2017-02-19