大孔树脂纯化黄花败酱总皂苷提取物工艺研究

蒋立英

（江苏医药职业学院药学院，江苏盐城224000）

大孔树脂纯化黄花败酱总皂苷提取物工艺研究

蒋立英

（江苏医药职业学院药学院，江苏盐城224000）

以黄花败酱皂苷提取物为原料，吸附率与洗脱率为衡量指标，考察5种大孔树脂对黄花败酱提取物中皂苷类化合物的静态吸附与洗脱性能，结合静态吸附动力学研究，确定选择AB-8型大孔树脂纯化黄花败酱提取物中皂苷类化合物。利用动态吸附-洗脱试验，得出最佳纯化工艺条件为：配置0.30 mg/mL的黄花败酱提取液，以2 BV/h流速，上样至径高比为1∶10的AB-8型树脂中吸附，随后采用5 BV的70%乙醇溶液，以2 BV/h流速洗脱。经高效液相色谱法定量分析表明，黄花败酱提取物中总皂苷含量由纯化前350.6 mg/g提高至纯化后846.9 mg/g。

黄花败酱；总皂苷；大孔树脂；纯化

黄花败酱系属败酱科败酱属植物黄花败酱的根、茎或带根全草，在我国分布广泛，因具有清热解毒、活血破瘀、镇心安神之功效，而用于各类疾病的治疗[1-3]。黄花败酱所含化学成分种类丰富，主要为三萜皂苷类、环烯醚萜类、黄酮类、香豆素类、挥发油类、倍半萜类和木脂素类[4-6]。由于其有效成分三萜皂苷类化合物（皂苷甘元：齐墩果酸）具有促进肝细胞再生、防止肝硬化、拮抗肿瘤细胞生长、增强机体免疫功能等作用[7-9]，从而前人对其有效提取与分离作了大量工作[10-11]，但诸多提取方法产物均含有较多杂质，使得目标产物含量偏低，影响功效发挥。

大孔树脂吸附分离，综合机械筛分与化学吸附的优点，具有选择性高、干扰因素少、可重复循环利用等特点，被广泛应用于天然产物有效成分的分离和纯化[12-13]。本研究在黄花败酱总皂苷提取工艺研究的基础上，利用大孔树脂纯化提取产物，采取高效液相色谱法定量分析，探究最佳纯化工艺，为黄花败酱皂苷类化合物的进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄花败酱全草：湖北随州。

齐墩果酸：定量分析用，中国药品生物制品检定所；甲醇、甲酸：色谱纯；其余试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。

1290型高效液相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；AE224型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；878-A/B型高速多功能粉碎机：常州国华电器有限公司；AB-8、D101型大孔树脂：陕西蓝深陕特种树脂有限公司；HPD-300、HPD-600型大孔树脂：沧州宝恩吸附材料科技有限公司；NKA-9：南开化工有限公司；HH-1J恒温水浴锅：常州润华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

取黄花败酱全草1 kg，清水洗净，40℃下烘干，完全粉碎后过80目筛。精密称取粉末10.0 g，采用10倍量的60%乙醇溶液回流提取两次，每次2 h，合并提取液浓缩后，加入乙醇20 mL与盐酸4 mL，加热水解4 h，蒸干即得黄花败酱总皂苷提取物[10]。

1.2.2 定量分析方法

1.2.2.1 对照品溶液配制

称取齐墩果酸对照品0.025g，加入甲醇溶液溶解完全后，定量转移至25 mL容量瓶中，摇匀，得到浓度为1.0mg/mL的对照品溶液。

1.2.2.2 供试品溶液配制

称取黄花败酱提取物0.01 g，加入甲醇超声完全溶解后，过滤，滤液定量转移至50 mL容量瓶中，摇匀。

1.2.2.3 色谱条件

采用Ultimate xB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为甲醇，B为0.5%甲酸；梯度洗脱程序（0～30 min，70%→95%A）；流速 1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：210 nm；进样量：10 μL[14]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

精密量取对照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、5.0 mL 置于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度摇匀，按照“1.2.2.3”项的色谱条件，分别连续进样3次，以齐墩果酸浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到方程Y=2 475.1X+1 587.4（r=0.9997），结果表明，齐墩果酸浓度在50μg/mL～500μg/mL时，线性关系良好。

2.2 含量测定

取供试液 10 μL，按照“1.2.2.3”项的色谱条件，连续进样3次，按照外标法以峰面积计算出样品提取物中总皂苷含量，结果见表1所示。

表1 黄花败酱提取物中总皂苷含量Table 1 The content of total saponins of Patrinia Scabiosaefolia Fisch extract

2.3 纯化工艺研究

2.3.1 树脂预处理

将大孔树脂浸泡于90%乙醇中24 h，充分溶胀后湿法装柱，后用90%乙醇反复冲洗，直至流出液与水混合（V液∶V水=1∶5）无白色浑浊出现，再用水洗至无乙醇气味，加入3%盐酸浸泡3 h，用水洗至中性；再用3%氢氧化钠溶液浸泡3 h，用水洗至中性，备用[15]。

2.3.2 大孔树脂型号筛选

称取2.0g5种不同类型的大孔树脂（D101、HPD-300、AB-8、NKA-9、HPD-600）于锥形瓶内，分别加入等浓度的黄花败酱总皂苷提取液50 mL，放置于振动器中，静态吸附24 h，使大孔树脂吸附总皂苷达到饱和，随后过滤，蒸干滤液。通过下式计算得到不同类型大孔树脂静态饱和吸附量与吸附率。

式中：m0为提取液总皂苷质量，mg；me为饱和吸附后滤液中总皂苷质量，mg；m为干燥的大孔树脂质量，g；Γe为静态饱和吸附量，mg/g；Qe为静态饱和吸附率，%。

将过滤后的树脂置于锥形瓶内，加入60%乙醇30 mL，放于振动器中，洗脱24 h，过滤，测定滤液总皂苷含量，通过下式计算洗脱率与回收率。不同类型树脂对黄花败酱提取物中总皂苷的吸附量、吸附率和洗脱率与回收率结果见表2所示。

式中：m0为提取液总皂苷质量，mg；me为饱和吸附后滤液中总皂苷质量，mg；md为洗脱液总皂苷质量，mg；Dd为静态洗脱率，%；R为回收率，%。

表2 不同类型树脂的静态吸附与洗脱性能比较Table 2 Comparison of static adsorption and desorption performance of different macroporous resins

从表2中可知，AB-8型大孔树脂的吸附率、洗脱率及回收率均高于其它4类树脂，分别达到87.16%、95.5%和83.24%，这归因于黄花败酱总皂苷的化学结构上含有羧基和羟基，具有一定的极性，AB-8型大孔树脂特殊的空间结构与弱极性，恰好与总皂苷容易产生较好的物理吸附和洗脱，从而确定其作为纯化黄花败酱总皂苷的吸附树脂。

2.3.3 AB-8型大孔树脂静态吸附动力学

根据“2.3.2”中静态吸附试验条件，在不同时间段测定AB-8型大孔树脂静态吸附总皂苷质量，绘制静态吸附动力曲线，见图1所示。

图1 AB-8型大孔树脂静态吸附动力曲线Fig.1 Static adsorption curve of AB-8 resin

在0～6 h范围内，吸附量随着时间的增长而增大，随后达到饱和状态。AB-8型大孔树脂静态吸附黄花败酱提取物中总皂苷耗时理想，能够满足相关工业生产要求。

2.3.4 吸附条件研究

采用L9（34）正交试验法，以总皂苷动态吸附量为衡量指标，考察上样液质量浓度、上样流速和径高比对吸附效果的影响，相关因素水平表见表3所示。按照正交试验表中条件（表4），配置9份等体积不同浓度的黄花败酱总皂苷提取液，上样至预处理完成的等量大孔树脂中吸附，收集流出液，蒸干，测定总皂苷量，相关方差分析见表5所示。

表3 正交试验因素水平表Table 3 Table of the factorial experiment

表4 吸附条件正交试验结果Table 4 Results of the orthogonal-test method of adsorption factors

表5 总皂苷吸附条件方差分析Table 5 Analysis of variance for the adsorption factors of total saponins

从表4和表5的结果分析可知，各因素对大孔树脂吸附黄花败酱提取物中总皂苷效果的影响顺序为A＞C＞B，上样液质量浓度对吸附效果影响显著，最佳吸附工艺条件为A2B2C3。上样液总皂苷浓度越大，单位面积树脂的吸附量越多，当浓度大到一定程度时，传质减慢，树脂吸附达到饱和，未被吸附的总皂苷则泄露流出。同时，较慢的上样流速有利于吸附，但过慢会使得效率降低、时间延长，而太快又不利于有效成分被充分吸附，从而选择配置0.30 mg/mL的黄花败酱提取液，以2 BV/h流速，上样至径高比为1∶10的AB-8型大孔树脂中，吸附黄花败酱提取液中总皂苷。

2.3.5 洗脱条件研究

吸附后的树脂需进行洗脱，才能得到含量较高的皂苷类化合物，为此以总皂苷动态洗脱率为衡量指标，采用L9（34）正交试验法，考察洗脱剂乙醇体积分数、流速和用量对洗脱效果的影响，相关因素水平见表6所示。依照正交试验表所述条件（表7）进行洗脱，收集9份洗脱液，减压浓缩，真空干燥后，测定总皂苷洗脱量，计算洗脱率，相关方差分析见表8所示。

表6 正交试验因素水平表Table 6 Table of the factorial experiment

表7 洗脱条件正交试验结果Table 7 Results of the orthogonal-test method of desorption factors

表8 总皂苷洗脱条件方差分析Table 8 Analysis of variance for the desorption factors of total saponins

从表7和表8的结果分析可知，各因素对洗脱效果影响的顺序为A＞C＞B，乙醇浓度对洗脱效果影响显著，最佳洗脱工艺条件为A3B2C2。乙醇体积分数越大，则洗脱剂极性愈小，愈容易将总皂苷从树脂表面洗脱，另外适当的洗脱流速也有利于将目标化合物充分洗脱，不延长洗脱时间，从而确定选用5 BV的70%乙醇溶液，以2 BV/h流速洗脱树脂吸附的黄花败酱提取物中的总皂苷，洗脱率为97.02%。

2.4 纯化前后总皂苷含量的比较

纯化黄花败酱提取物中总皂苷的最佳工艺为：配置0.30 mg/mL的黄花败酱提取物，以2 BV/h流速，上样至径高比为1∶10的AB-8型大孔树脂中吸附，随后采用5 BV的70%乙醇溶液，以2 BV/h流速洗脱。纯化后样品高效液相色谱图见图2所示，纯化前后黄花败酱提取物的总皂苷含量见表9。

图2 纯化后样品高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of sample after purification

表9 纯化前后黄花败酱提取物的总皂苷含量Table 9 The content of total saponins of Patrinia Scabiosaefolia Fisch extracts before and after purification

从表9结果可知，黄花败酱总皂苷含量由纯化前350.6 mg/g提高至纯化后846.9 mg/g，为纯化前的2.42倍。

3 结论

本研究选用了5种大孔树脂纯化黄花败酱提取物中的总皂苷，研究结果显示：配置0.3 mg/mL的黄花败酱提取物，以2 BV/h流速，上样至径高比为1∶10的AB-8型树脂中吸附，随后采用5 BV的70%乙醇溶液，以2 BV/h流速洗脱，所得洗脱液总皂苷含量为纯化前的2.42倍。该工艺操作简便、纯化效率较高，从而可推广至相关工业应用中。

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Study of the Purification Technology for Total Saponins from Patrinia Scabiosaefolia Fisch by Macroporous Resin

JIANG Li-ying
（College of Pharmacy，Jiangsu Vocational College of Medicine，Yancheng 224000，Jiangsu，China）

In order to find the most appropriate macroporous resin to purify total saponins from Patrinia Scabiosaefolia Fisch extract.The static adsorption and desorption performance of five kinds of macroporous resins and combined with the kinetics of static adsorption for total saponins from Patrinia Scabiosaefolia Fisch extract were investigated by different adsorption and desorption ratios.AB-8 resin was found to be suitable for the purification of total saponins from Patrinia Scabiosaefolia Fisch by using dynamic adsorption and desorption experiments，the optimum purification conditions were obtained as follows：0.3 mg/mL Patrinia Scabiosaefolia Fisch extract was loaded on to the resin column which the ratio of diameter-high was 1∶10 at flow rate of 2 BV/h and eluted with 5 BV of 70%ethanol at flow rate of 2 BV/h.Under these conditions，the content of total saponins of Patrinia Scabiosaefolia Fisch extract was increased from 350.6 mg/g to 846.9 mg/g by quantitative analysis of high performance liquid chromatography.

Patrinia Scabiosaefolia Fisch；total saponins；macroporous resin；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.007

江苏高校品牌专业建设工程资助项目（PPZY2015A097）；商丘市科技局科技公关项目（153063）

蒋立英（1971—），女（汉），主管药师，硕士，研究方向：天然产物分析。

2017-02-07