RT-LAMP及RT-PCR方法快速检测玉米褪绿斑驳病毒的比较与应用

单长林，周 圆，李孝军，杨赛军，邵炜冬

（舟山出入境检验检疫局，浙江 舟山 316021）

RT-LAMP及RT-PCR方法快速检测玉米褪绿斑驳病毒的比较与应用

单长林，周 圆，李孝军，杨赛军，邵炜冬

（舟山出入境检验检疫局，浙江 舟山 316021）

利用玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白基因为靶标序列设计引物，通过优化反应温度、引物浓度、反应时间以及评价环引物效果，建立了检测玉米褪绿斑驳病毒反转录环介导等温扩增 （RT-LAMP） 方法，并与RT-PCR方法比较。结果表明，RT-LAMP在64℃等温条件下反应45 min，最低可检测到280 fg的目的片段，灵敏度是RT-PCR的100倍。以甘蔗花叶病毒、玉米矮花叶病毒、小麦线条花叶病毒、玉米白线花叶病毒及玉米褪绿斑驳病毒等5种病毒为检测对象，证明该方法针对玉米褪绿斑驳病毒具有很强的特异性。利用RT-LAMP方法对100份模拟病毒感染的玉米种子进行检测，病毒检出率为100%。

玉米褪绿斑驳病毒；反转录环介导等温扩增方法；RT-PCR；检测

玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）是侵染玉米的重要病毒，主要通过种子远距离传送等方式传播［1-3］，可侵染玉米、高粱等多达15～19种植物［4］，目前主要分布在墨西哥、美国部分地区、秘鲁、阿根廷、法国、希腊、意大利、罗马尼亚、西班牙、瑞士、澳大利亚、厄瓜多尔、南非、尼日利亚、肯尼亚、埃塞俄比亚、刚果、卢旺达及泰国等地［5-12］。有研究表明，该病毒既可以单独侵染玉米，也可与小麦线条花叶病毒（WSMV）［13］、甘蔗花叶病毒（SCMV）［14-15］、玉米矮花叶病毒（MDMV）［15］复合侵染，导致玉米致死性坏死病。

2007年我国将MCMV列为进境检疫性有害生物。2010年我国首次从进口玉米种子中检出MCMV［16］，1年之后，Xie L等在我国云南的玉米植株上发现了MCMV［17］，到2015年，Deng等又在台湾省甜玉米上检测出MCMV［18］。饶玉燕等通过构建MCMV损失评判指标体系，对其在我国潜在经济损失作出评估，高达140.95亿元［19］。加强进境粮食检验检疫监管，防范玉米褪绿斑驳病毒的入侵与扩散迫在眉睫。

目前针对MCMV的检测方法主要有酶联免疫法（ELISA）、RT-PCR、实时荧光RT-PCR方法、表面等离子生物传感器法等［20-22］。酶联免疫法对快速检测意义重大，但由于包被抗体特异性不强及保存不当等原因，易出现假阳性等问题；实时荧光RT-PCR技术，存在需大型仪器设备支持且运行成本高等问题，不利于基层检测现场推广。环介导等温扩增技术（LAMP）是由日本学者Notomi研发的一种恒温扩增反应，可在恒温条件下1 h内完成反应，结果清晰肉眼可辨，反应灵敏度高，准确性和特异性好且不需要大型仪器支持［23］。RT-LAMP 是在 LAMP 基础上，加入反转录酶，使反转率和核酸扩增同时进行，其独有的检测优势迅速得到广大科研工作者的偏爱，广泛应用于动植物病原微生物检测［24-26］。

本研究主要利用RT-LAMP技术，并与RTPCR比较，分析其特异性和灵敏性，建立一种简便易操作、特异性强、灵敏度高的方法快速检测玉米褪绿斑驳病毒，为该病毒的田间诊断、口岸现场检疫等提供更好的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米褪绿斑驳病毒、甘蔗花叶病毒由浙江大学农业与生物技术研究所吴建祥教授提供，玉米矮花叶病毒、小麦线条花叶病毒及玉米白线花叶病毒（MWLMV）阳性质控物购自美国Agdia公司。

试剂、仪器：RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技有限公司），PrimeScriptTM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit（大连宝生物公司），Fluorescent Detection Reagent、RNA Amplification Kit （日本荣研公司）；

LA-320C实时浊度仪（日本荣研公司），PCR仪（ABI），NANODROP2000分光光度计（Thermo），凝胶成像系统（Bio-Rad）

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计合成 根据GenBank 发布的MCMV 外壳蛋白cDNA序列（登录号分别为 AM490793.1，JQ943666.1，GU594293.1，JF422772.1，AY587605.1），通过 MEGA 6 软件进行比对分析，找出外壳蛋白基因3′端保守序列，以此为模板，使用在线软件Primer3 Input（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/），设计5条引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。序列比对结果及靶序列结合区域见图1。

表1 玉米褪绿斑驳病毒RT-LAMP 检测引物

图 1 序列比对分析结果及各引物在基因组中对应的位置

1.2.2 总RNA 提取 取病毒样品和健康玉米叶片，利用植物总RNA提取试剂盒分别提取RNA，用NANODROP 2000分光光度计测定核酸浓度（表2）与纯度，-80℃下保存备用。

表 2 测定的几种病毒的 RNA 浓度

1.2.3 RT-PCR 检测 利用反转录试剂盒PrimeScript TM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit将提取的RNA反转录成 cDNA ，-20℃保存备用。

采用 Primer Premier 5.0 设计 RTPCR 引物：F-MCMV：TTATGCCACAAAA CCGCACTGT；R-MCMV：TAGGATTGCTGCT CCACGGT。扩增片段大小为190 bp。反应体系为 10μL 2×Taq PCR StarMix，1μL 引物F-MCMV / R-MCMV（10 umol/L），1μL模板cDNA，加水至20μL。PCR反应条件为94℃预变性 3 min；94℃变性 30 s，53℃退火 40 s，72℃延长1 min，进行35次循环；72℃延伸5 min。反应结束后，取5μL反应产物，1.6 %琼脂糖凝胶电泳 30 min（100 V），紫外成像检测。

1.2.4 RT-LAMP 检测体系的优化 基本检测体系为：12.5μL 反应缓冲液 RM，1.0μL 酶溶液EM，1.0μL 荧光目视检测试剂钙黄素，1.0μL 模板 RNA，终浓度为 1.6μmol/L的MCMV-FIP/MCMV-BIP和终浓度为0.2μmol/L的MCMV-F3/MCMV-B3，最后加水至25μL。RT-LAMP反应条件为 63℃ 1 h，80℃ 5 min。LA-32℃实时浊度仪检测浊度变化，并在反应结束后观察荧光目视染料是否由橙色变为绿色。

分别对反应温度、引物浓度设置不同梯度进行优化。将反应温度设置为62、63、64、65℃，保持其他因素不变以筛选出最佳反应温度；再将MCMV-FIP/MCMV-BIP（MCMV-F3/MCMV-B3）引物终浓度设置为1.0（0.125）、1.2（0.15）、1.4（0.175）、1.6（0.2）、1.8（0.225） μmol/L，保持其他因素不变以筛选出最佳引物浓度；最后以（FIP/BIP）∶（LB）∶（F3/B3）=8∶4∶1加入环引物MCMV-LB以验证环引物效果。试验中用灭菌水为模板，以基本检测体系进行阴性对照。

1.2.5 RT-LAMP 与 RT-PCR特异性比较 以MCMV、SCMV、MDMV、WSMV和MWLMV的RNA为模板，进行RT-LAMP检测，观察浊度及目视试剂颜色变化；同时进行RT-PCR检测，凝胶电泳验证。比较分析两种方法的特异性。

1.2.6 RT-LAMP 与 RT-PCR灵敏度测定 以提取的MCMV RNA为原液，用RNase Free dH2O将RNA进行10倍梯度稀释，分别获得原液（280 ng/μL）、10倍稀释液（28 ng/μL）、102倍稀释液（2.8 ng/μL）、103倍稀释液（280 pg/μL）、104倍稀释液（28 pg/μL）、105倍稀释液（2.8 pg/μL）、106倍稀释液（280 fg/μL）、107倍稀释液（28 fg/μL）、108倍稀释液（2.8 fg/μL）。根据建立的RT-LAMP 反应体系进行扩增，观察浊度及目视试剂颜色变化；同时进行RT-PCR反应，凝胶电泳验证。比较分析两种方法的灵敏性。

1.2.7 RT-LAMP检测玉米种子样本的应用 选取三叶期玉米幼苗（品种为农大108），摩擦接种，15 d后表现典型症状，采集新鲜叶片，-20℃保存备用。

将收集到的叶片与PBS缓冲液按照质量比1∶1等比例研磨，纱布过滤获取病毒液，备用。选取健康玉米种子研磨成粉末，与10倍梯度稀释病毒液混匀，模拟种子带毒，作为待测样本（100个）。利用植物总RNA 提取试剂盒提取模拟待测样本RNA，同时进行RT-LAMP和RT-PCR检测。

2 结果与分析

2.1 RT-LAMP 检测体系优化

2.1.1 最适反应温度的选择 试验设62、63、64、65℃4个反应温度梯度，结果（图2）显示，在64℃条件下，反应浊度超出检出限（浊度AABs=0.2）仅需要 24 min，到达平台期（浊度AABs=0.8）仅需要37 min；而65℃则分别需要 26、39 min，62℃需要 33、47 min ，63℃需要35、54 min。因比当反应温度为64℃时，反应进行最为迅速。

图2 RT-LAMP 不同反应温度试验

2.1.2 引物浓度优化 将引物MCMV-FIP/MCMV-BIP（MCMV-F3/MCMV-B3）反应浓度设置为1.0（0.125）、1.2（0.15）、1.4（0.175）、1.6（0.2）、1.8（0.225）μmol/L等5个浓度梯度，结果（图 3）显示，在引物浓度为1.8（0.225）μmol/L条件下，反应浊度超出检出限（浊度AABs=0.2）仅需要 27 min，到达平台期（浊度AABs=0.8）只需要39 min，其他浓度条件下到达检测限和反应平台期的时间（分别为54、＞60 min，45、57 min，43、53 min，35、54 min）均有所延迟。因此最佳引物浓度为1.8（0.225）μmol/L。

图3 RT-LAMP 反应不同引物浓度试验

图4 RT-LAMP中环引物效果试验

2.1.3 环引物效果 由图 4可知，未加入环引物反应在27 min 时浊度达到检测线（AABs=0.2），且达到平台期（AABs=0.8）需要长达39 min；加入环引物后，浊度达到检测线时间提前到21 min，反应进行到平台期所用时间减少6 min。由此可见，环引物可加速反应，效果明显。

2.1.4 RT-LAMP 检测体系的确定 经过以上对RT-LAMP反应温度、引物浓度及环引物加入与否等条件的优化，确定RT-LAMP检测体系为：12.5 μL 反应缓冲液 RM，1.0 μL 酶溶液EM，1.0 μL 荧光目视检测试剂钙黄素，1.0 μL 模板RNA，终浓度为1.8μmol/L的MCMVFIP/MCMV-BIP，终浓度为 0.225μmol/L 的MCMV-F3/MCMV-B3和终浓度为0.45μmol/L的MCMV-LB，最后加水至25 μL。由图5可知，整个反应在45 min内可以完成，故RT-LAMP反应条件为64℃ 45 min。

2.2 特异性检测

以 SCMV、WSMV、MDMV、MWLMV及MCMV的RNA为模板进行RT-LAMP检测，结果（图5）显示仅有MCMV进行扩增反应，反应在45 min内完成且目视试剂颜色由橙黄色变为绿色；RT-PCR反应结果（图6）显示仅有以MCMV为模板的反应扩增出190 bp大小的条带。由此可知，RT-LAMP与RT-PCR均能特异性检测MCMV。

图5 RT-LAMP 特异性验证

图6 RT-PCR特异性验证

2.3 灵敏度检测

将 RNA 原液、101、102、103、104、105、106、107、108倍稀释液分别作为模板，利用所建立的RT-LAMP 反应体系和RT-PCR检测方法进行灵敏度比对。从图7可以看出，RT-PCR 以103倍稀释液为模板可以检测到显著的条带；以104倍稀释液为模板，电泳检测的条带模糊不清；以105倍稀释液为模板，电泳没有检测到任何条带。而RT-LAMP 检测时，如图8所示，以106稀释液为模板，浊度仍可以在45 min内达到检测线（AABs=0.2）。因此，RT-LAMP检测MCMV的灵敏性比普通RT-PCR至少高100倍，并且RT-LAMP比RT-PCR节省时间，非常有利于MCMV的检测应用。

图7 RT-PCR灵敏度试验电泳结果

2.4 RT-LAMP检测玉米评价

利用植物总RNA提取试剂盒，提取100个模拟带毒玉米种子样本RNA，分别进行RTLAMP和RT-PCR 检测。结果表明，RT-LAMP方法对100个待测样本的病毒检出率为100%（100/100）；RT-PCR方法对100个待测样本的病毒检出率为78%（78/100），针对部分低病毒浓度模拟样本，由于灵敏度限制无法检出。

图8 RT-LAMP 灵敏度试验

3 结论与讨论

玉米在我国粮食生产中占据重要的地位，2012—2014年间，我国玉米进口总量超过1 000万t。玉米褪绿斑驳病毒随进口玉米传入我国的风险很高。为更好地服务口岸检疫部门，本研究利用RT-LAMP技术，建立针对MCMV的RTLAMP检测方法，并与普通RT-PCR方法进行比较，证实RT-LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高等优点。

实验中RT-LAMP反应中环引物的加入使反应达到检测线（AABs=0.2）及进入平台期（AABs=0.8）时间提前6 min，整个反应效率大大提高，确保RT-LAMP 检测在64℃等温条件下反应进行45 min即可完成，比RT-PCR反应过程节省约1 h 。在RT-LAMP反应中，利用浊度仪实时监测反应过程中浊度变化，将反应结果数据化，更加理性、客观。通过加入可视试剂钙黄素，使反应结果一目了然，避免传统凝胶电泳等过程，简化整个检测流程，节约时间且有效避免反应产物交叉污染等问题，且整个反应过程不需要大型仪器设备的支持，方便口岸现场实验室检疫。

本实验建立的RT-LAMP检测方法，快速、灵敏且特异性强，能满足针对玉米褪绿斑驳病毒的田间诊断、口岸现场检疫的要求。

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Comparison and application of RT-LAMP and RT-PCR methods for MCMV detection

SHAN Chang-lin，ZHOU Yuan，LI Xiao-jun，YANG Sai-jun，SHAO Wei-dong
（Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan 316021，China）

For the detection of Maize chlorotic mottle virus（MCMV），a reverse-transcription，loop mediated isothermal amplification（ RT-LAMP） assay with high sensitivity and specificity was established. A set of five primers were designed，based on the coat-protein sequence of MCMV. By optimizing the concentration of primers，the best temperature，the suitable reaction time，and loop primer，the RT-LAMP was built by incubation at 64℃ for only 45 min with loop primer. The detection limit of RT-LAMP assay was 280 fg of MCMV RNA，which was 100 times more sensitive than that of RT- PCR assay. High species-specificity of RT- LAMP method was confirmed by the assay of 5 pathogens such as MCMV，SCMV，MDMV， WSMV and MWLMV. In addition，all the simulated samples were detected by LAMP assay，detection rate was 100%.

MCMV；RT-LAMP；RT-PCR；detection

S435.131.4

A

1004-874X（2017）07-0083-08

单长林，周圆，李孝军，等. RT-LAMP及RT-PCR方法快速检测玉米褪绿斑驳病毒的比较与应用［J］.广东农业科学，2017，44（7）：83-90.

2017-04-26

舟山市科技计划项目（2015C31051）

单长林（1987-），男，硕士，助理农艺师，E-mail：changlin_shan@163.com

（责任编辑 杨贤智）