拟南芥衰老相关突变体lsm3的鉴定和基因克隆

岳丽晓，李登云，张玲玲

（郑州工业应用技术学院 医学院，河南 郑州 451100）

拟南芥衰老相关突变体lsm3的鉴定和基因克隆

岳丽晓，李登云，张玲玲

（郑州工业应用技术学院 医学院，河南 郑州 451100）

本研究采用叶绿素荧光成像技术，对叶衰老相关突变体进行筛选，研究使用材料为南芥T-DNA插入突变体库.表型重复后提取突变体的DNA，利用PCR技术和DNA琼脂糖凝胶电泳技术对突变体进行T-DNA插入验证.然后采用TAIL-PCR技术扩增T-DNA两翼序列，对目的条带回收测序，最后分析测序结果确定叶衰老突变体的候选基因.

拟南芥；衰老相关基因；叶绿素荧光；T-DNA；突变体

1 前言

1.1 研究目的与意义

由于细胞、器官、组织或者整个植株水平的生理功能衰退称为植物衰老，植物衰老最终会表现为植物生命周期的结束，或者植物的自然死亡[1].植物叶片衰老不仅代表了植物生命周期的结束，而且对于研究发育生物学有重要的作用.有些作物会产生种子，当发生衰老，叶片同化功能就会退化，从而影响作物的产量，包括大部分农作物，无法充分发挥作物产量的潜力，对于蔬菜作物来说也是如此，影响采摘质量[2].在农业生产中，控制叶片衰老，有针对性地进行防治，对于延长农产品的贮藏期，或者提高作物的产量有重要的意义.对叶片衰老的深入研究，可以帮助更好地了解叶片的发育过程，并且利用研究的成果，进行农业指导，控制叶片衰老，促进农业的发展，为人类造福.

1.2 叶片衰老机制的研究现状

叶衰老尽管是由发育阶段决定，但它同样受激素和环境信号的调控.影响衰老的主要外部因素有：紫外线、臭氧、遮蔽、氯化钠等；影响植物衰老的内部因素有：生长素、水杨酸、ABA、乙烯、赤霉素等[3].叶衰老开始后，光合作用相关基因表达得到削弱，而与此同时却有众多的基因表达量获得增加，这些基因被命名为衰老诱导基因SAGs.通过进一步的研究观察发现，在调控叶衰老的过程中，转录因子发挥着一定的作用，比如转录因子WRKY70可以对叶衰老的起始进行调控[4].上世纪四十年代，研究者们发现，从光合有机体发射出的叶绿素荧光，和自身的光合活性有密切的关系[5-6].利用叶绿素荧光成像仪，能够对叶片PSII中的电子传递效率进行测定，并且没有任何侵害，测定速度较快[7].

1.3 叶绿素荧光成像技术在叶衰老方面的研究应用

叶绿素荧光几乎全部来源于PSII的Chla，活体叶绿素荧光提供的快速信息仅能反映PSII对激发能的利用和耗散情况.本实验通过对发射光的能量大小的调制，获得相关的光合参数，进一步了解光合能力的强弱[8].通过测定衰老的水稻叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm，发现叶绿素的含量越高，叶片的光合作用越大，光合作用和叶绿素含量有正相关的关系.Rubisco的含量，以及Rubisco活性与光合速率也有正相关关系，降低Rubisco含量和活性，会导致光合速率的降低.黑暗处理拟南芥保绿突变体pph-1，对比于野生型，叶绿素荧光参数Fv/Fm下降更多，表示受衰老影响的叶绿体降解，能够较大作用于pph-1的光合作用能力[9].研究AtNAP化学诱导性超表达植株显示，使用地塞米松外源进行处理，叶片出现早衰，并且黄化严重，并且Fv/Fm比值有大幅下降.该基因的回补转基因苗显示野生型，Fv/Fm比值变化，与其表型变化相同[10].本实验利用叶绿素荧光成像技术筛选叶衰老相关突变体是可行的，并在此基础上用TAIL-PCR技术进行基因的扩增分析.

2 实验过程

2.1 实验材料

野生生态型Col-0、T-DNA突变体.

2.2 培养基及常用溶液的配制

MS固体筛选培养基，0.1%升汞、溴化乙锭溶液、TAE缓冲液、DNA上样缓冲液、DEPC处理的水、DNA提取液、甘露醇(Man)溶液、考马斯亮蓝G-250染料试剂、甲基磺酸乙酯诱变液、10×PCRbuffer.

2.3 实验方法

2.3.1 点种.取定量拟南芥干燥的种子，消毒，再用无菌水冲洗，经过处理后点播在MS固体培养基上，于4℃条件下春化3天，放于培养间中培养12天后供实验用.

2.3.2 衰老突变体的鉴定.将生长12天的幼苗进行叶绿素荧光成像，筛选出Fv/Fm较野生型拟南芥差别较大的，继续培养一段时间后将其移至土中.待幼苗生长两周左右后，对其进行叶绿素荧光成像分析.然后将其遮光暗处理四天进行叶绿素荧光成像分析，筛选Fv/Fm较野生型差异较大的个体留作实验用.

2.3.3 T-DNA插入的鉴定.(1)DNA的提取.剪取上述步骤中筛选出的拟南芥幼苗的两片叶子，置于1.5mL的EP管中，并加入100μLDNA提取液充分研磨.再往管中加入600μLDNA提取液，混匀后在4℃、12000rpm条件下高速离心15min.弃去沉淀，吸取上清至新的EP管中，并往上清液中加入等体积的异丙醇700μL，使DNA沉淀摇匀，于-20℃过夜沉淀.将过夜后的溶液 4℃、12000rpm离心10min，沉淀DNA，弃上清，留沉淀.在沉淀中加入1mL体积分数为20%的酒精，再在4℃、12000rpm的条件下高速离心5min.倒去酒精，将EP管倒置于吸水纸上风干，向管中加入30μL无菌去离子水，并在离心机上短甩后置于-20℃条件下保存.

(2)DNA的扩增.扩增上述步骤所获的DNA.PCR反应体系如下：（单位：μL）

buffer 2 dNTP 2引物(LP&RP) (1+1)Taq酶 0.2 H2O 11.8 DNA 2

(3)琼脂糖凝胶电泳.采用琼脂糖凝胶电泳处理扩增产物，首先称取1g琼脂糖，准备100mlTAE，将琼脂糖加入TAE中加热，直到全部熔化.静置一定时间降低温度后，在混合物中加入溴化乙锭，并混匀，溴化乙锭为0.5mg/ml，5μL.将所得物质放入制胶槽中，将梳子插入，等到凝固完成，小心拔出梳子，将凝胶和支撑物全部放入电泳槽中，加入电泳缓冲液体，液面比凝胶高1mm.再加入上述TAIL-PCR反应第三轮的产物和Marker.电压为180V，溴酚蓝移动，直到在凝胶距离2cm左右，电泳操作停止，进行观察和拍照，保留数据和图像.因插入T-DNA的基因过长，在设定的PCR反应中无法扩增，故无条带的即为所需筛选的T-DNA插入突变体.

2.3.4衰老相关基因的鉴定.（1）T-DNA插入旁侧序列的扩增.该过程采用的是TAIL-PCR技术，TAIL-PCR技术是通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合，进行PCR循环，共采取三轮连续操作.AD引物Tm值为44℃到46℃，特异性引物的为57℃到62℃.热循环程序采用低温随机扩增，高温特异性扩增，相间进行，扩增特异产物，对随机引物产生的非特异性扩增进行抑制，得到的片段可以直接用作测序模板、探针标记.（2）琼脂糖凝胶电泳及胶回收.将第三轮PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯环境下切出琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶含有DNA，吸取干净其表面的液体，然后称重计算体积.1mg=1μL作为计算体积的标准.在胶块中加入DR-I溶液，混合均匀，进行加热，将胶块融化，并进行振荡充分混合.再次加入一半DR-I溶液，混合均匀.后经多次滤过、离心、洗脱获得DNA.（3）测序.将上述实验过程中得到的DNA送往生物公司进行测序，比照拟南芥基因组图谱确定基因.

3 结果与分析

3.1 叶衰老突变体lsm3表型鉴定

在此实验基础上，筛选到一批潜在的叶衰老相关突变体.分别将这些突变体单株收种，对其进行表型重复剔除假阳性突变体，共获得表型稳定且能够稳定遗传的叶衰老相关突变体15株，在本研究中对其中的一种突变体lsm3做了具体表型分析和基因克隆.如图所示，在暗处理前，突变体与野生型之间在叶绿素荧光参数Fv/Fm指标上无差别，暗处理三天后，lsm3的Fv/Fm值明显低于野生型.之后野生型和突变体之间的差异消失，说明lsm3确为叶衰老突变体.

图1 突变体暗处理前后叶绿素荧光参数的变化

3.2 LSM3基因克隆

为使基因功能研究效果更好，采用TAIL-PCR技术对该基因进行克隆.首先对lsm3其进行了T-DNA插入验证.因PCR扩增所用的特异引物是根据T-DNA序列设计的，所以只有T-DNA插入的突变体才能扩增出目的条带.电泳结果如图2，lsm3突变体能够扩增出大约1000bp的目的条带，而野生型则无任何条带出现，说明lsm3确为T-DNA插入突变体.

图2 T-DNA插入验证结果

第二轮TAIL-PCR反应中，扩增到1个特异条带，其长度500bp左右.以第2轮反应的产物为基础模板，进行PCR循环扩增，最终得到一个片段，长度大约400bp.在操作中，为了防止扩增出现问题，采用琼脂糖凝胶电泳进行分析，分别用第二轮的产物和第三轮的产物.特异引物具有嵌套的特点，因此第三轮的产物比第二轮反应产物小，两者的距离和引物的位置相差距离一致，即片段长度和LexA4和LexA5在T-DNA上的位置差相同.回收作为特异性目标片段的第三轮产物，进行测序表明，T-DNA插入到LSM3基因内部，引起突变体对干旱敏感的表型.

图3 TAIL-PCR产物电泳和测序结果

4 讨论

总的来说，跟其它基因克隆的方法相比,TAIL-PCR优势更多，第一是操作简单，能够节省许多时间，模板可以直接采用基因组DNA，并且这种方式不会要求很高纯度和数量的模板，通常只需要几个ng的DNA即可，可快速获得目标片段.第二成本低：TAIL-PCR只需要设计几个嵌套特异引物和简并引物即可，节省成本，但是传统的方式要求较高的实验技术和样品质量，在RNA的提取、纯化等过程中，需要耗费许多时间和成本，才能得到结果，与TAIL-PCR完全相反.第三TAIL-PCR具有较高的灵敏性和特异性.采用短的简并引物，结合长的特异性嵌套引物，在分级反应、不对称温度循环下，可以扩增特异引物，并且最终产物质量较高，扩增产物中的目的片段有绝对优势，能够直接用作测序模板和探针标记.但是TAIL-PCR技术也有一些缺点.第一是要求反应条件比较精细，需要连续三轮的嵌套反应，并且每一轮十分重要，如果一轮出现问题，就会对下一轮造成影响，从而影响最终的结果，无法保证实验的准确性.第二TAIL-PCR需要的引物组合比较多，不同的AD引物结合位点也有不同，AD引物结合位点有限，不是每次结果都是阳性，个别扩增中，即使不同的简并引物，也可能不能得到阳性结果.

实验最终获得结果说明利用叶绿素荧光成像技术和TAIL-PCR来鉴定拟南芥衰老相关基因切实可行.本实验只是初步鉴定了与衰老相关的该种基因，为了使TAIL-PCR的实验结果更加真实可靠，对实践指导更有意义，需要进一步的研究观察，采用RT-PCR对突变体基因的情况进行检验，从而降低TAIL-PCR技术中可能出现的错误.

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Q78；Q945.48

A

1673-260X（2017）10-0009-03

2017-07-05

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