粒状头样2在肺纤维化上皮间质转化中的作用研究

孙建，代文静，邱静，李万成

(成都医学院第一附属医院呼吸内科，四川 成都 610500)

粒状头样2在肺纤维化上皮间质转化中的作用研究

孙建，代文静，邱静，李万成

(成都医学院第一附属医院呼吸内科，四川 成都 610500)

目的探讨粒状头样2(grainyheas-like2，GRHL2)在肺纤维化上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)中的作用研究。方法45只大鼠随机分为正常对照组，模型组及丙戊酸钠组，每组15只，模型组及丙戊酸钠组沿着气管注射博来霉素构建大鼠肺纤维化模型，正常对照组采用同样方法给予等量生理盐水。丙戊酸钠组大鼠腹腔注射200 mg·kg-1·d-1丙戊酸钠，正常对照组及模型组腹腔注射等量生理盐水，连续给药28 d。HE染色检测肺组织病理情况，Masson染色检测肺组织纤维化情况，碱水解法检测羟脯氨酸(HYP)含量，免疫组化及Western Blot检测GRHL2表达，Western Blot检测EMT相关蛋白E-cadherin，α-平滑肌细胞肌动蛋白(α-SMA)，Vimentin，Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达。结果与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织肺泡结构被破坏，大量胶原纤维沉积，胶原染色面积比、Ashcroft评分及HYP含量升高(P<0.01)，GRHL2阳性率及蛋白表达量降低(P<0.01)，E-cadherin表达量下调(P<0.01)，α-SMA，Vimentin，β-catenin，淋巴样增强结合因子(LEF)及基质金属蛋白酶7(MMP7)表达量上调(P<0.01)。与模型组比较，丙戊酸钠组大鼠肺泡组织结构较为完整，胶原纤维沉积程度较轻，胶原染色面积比、Ashcroft评分及HYP含量降低(P<0.01)，GRHL2阳性率及蛋白表达量提高(P<0.01)，E-cadherin表达量上调(P<0.01)，α-SMA，Vimentin，β-catenin，LEF1及MMP7表达量下调(P<0.01)。结论大鼠肺纤维化过程GRHL2表达量下调，进而激活Wnt/β-catenin信号通路，促进EMT生成，加重大鼠肺纤维化程度，丙戊酸钠能扭转此过程。

粒状头样2(GRHL2)；丙戊酸钠；肺纤维化；大鼠；上皮间质转化(EMT)；Wnt/β-catenin信号通路

肺纤维化是一种慢性的原因不明的肺间质炎性疾病，主要病理特点为肺泡腔、肺间质胶原纤维的生成、沉积及大量炎性细胞的浸润渗出[1-2]。目前研究认为肺泡上皮损伤后异常修复引起的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肺纤维化产生的重要原因，与肺纤维化的发生密切相关，而且在肺纤维化过程中，EMT上皮标记物E-cadherin表达量下调，促使β-catenin进入细胞核，使Wnt/β-catenin信号通路被激活，进而诱导EMT的产生，因此通过抑制Wnt/β-catenin信号通路继而干预EMT的生成已成为治疗肺纤维化重要机制之一[3-5]。粒状头样2(grainyheas-like2，GRHL2)是一种维持人类气道上皮形态、功能的重要转录因子，在维持着上皮功能的完整性方面发挥着重要作用[6]。研究显示，GRHL2能够表达于人胚胎时期的肺间质及特发性纤维化肺间质，但在肺纤维化间质中表达量下调[7]。GRHL2能够通过调控上皮的分化，上调E-cadherin表达，下调EMT间质标记物，最终遏制EMT的产生[8-9]，进而提示通过构建慢病毒下调GRHL2可能能够通过阻断Wnt/β-catenin信号通路继而扭转EMT的生成最终抑制肺纤维化的发展，但是慢病毒的构建较为复杂且不适用于临床。因此本研究将选取药物进行间接的干预。丙戊酸钠是一种组蛋白去乙酰基转移酶抑制剂，能够通过下调间充质标记物α-SMA表达，上调E-cadherin表达，继而减轻博来霉素诱导大鼠肺纤维化[10]。丙戊酸钠的调控机制是否与GRHL2的表达，Wnt/β-catenin信号通路有关尚未可知，因此本研究将对此推测展开研究。

1 材料和方法

1.1动物

(250±50)g的SD雄性大鼠45只，购于成都达硕实验动物有限公司，生产许可证：SCXK(川)2015-030。大鼠自由饮水摄食。使用许可证SYXK(川)2015-196，成都医学院。

1.2试剂及仪器

博来霉素购自哈尔滨博莱制药有限公司；兔抗GRHL2多克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗E-cadherin，α-SMA，Vimentin，β-catenin，LEF1及MMP7单克隆抗体购自美国宜百康公司；大鼠抗GAPDH单克隆抗体及BCA试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；羟脯氨酸含量(HYP)检测试剂盒购自北京索莱宝生物技术有限公司。迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪，ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司；MCS7200显微图像采集系统购自德国Leica公司。

1.3分组、模型建立及给药[11-12]

将45只大鼠随机分为正常对照组，模型组及丙戊酸钠组，每组15只。3组大鼠均用10%水合氯醛麻醉，并对颈部皮肤进行消毒，做切口使气管暴露出来，模型组及丙戊酸钠组沿着气管一次性慢慢的注射5 mg/kg的博来霉素，建立大鼠肺纤维化模型。正常对照组同样沿着气管间隙一次性注入0.3 mL的生理盐水。造模成功后，丙戊酸钠组大鼠腹腔注射给予200 mg·kg-1·d-1丙戊酸钠，正常对照组及模型组腹腔注射等量生理盐水。连续给药28 d。

1.4标本获得

3组大鼠于28 d处死，剖开胸腔取出右肺，一小部分用于羟脯氨酸含量检测，一部分用于HE染色，Masson染色，免疫组化及Wester Blot的检测。

1.5 HE染色

肺组织标本固定，包埋，切片后，于二甲苯，100%乙醇，95%、80%、75%乙醇，蒸馏水中脱蜡至水洗。苏木素染色，盐酸酒精分化，流水冲洗。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，于镜下观察。

1.6 Masson染色

石蜡标本于二甲苯，100%乙醇，95%、80%、75%乙醇，蒸馏水中脱蜡至水洗。苏木素染色，水洗后Masson丽春红溶液浸泡，在滴加1%磷钼酸分化，苯胺蓝染色，最后滴加1%冰醋酸分化。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，于镜下观察。胶原纤维被苏木素染色蓝色，而肌纤维染色红色，能够判断肺组织纤维化程度。采用Ashcroft评分对肺组织纤维化程度进行评分。采用Image pro plus6.0软件分析图像，染色面积比即为胶原纤维染色的面积占组织切片总的面积的比例。

1.7碱水解法检测大鼠肺组织中HYP含量

将50～100 mg左右的肺组织置于试管中，加入1 mL水解液，在95 ℃水浴中水解15 min，取稀释后的水解液于离心机中离心，于酶标仪560 nm处进行OD值的检测。

1.8免疫组化检测GRHL2的表达

石蜡标本于二甲苯，100%乙醇，95%、80%、75%乙醇，蒸馏水中脱蜡至水洗。枸橼酸盐缓冲液修复。10%山羊血清室温下封闭。一抗溶液(兔抗人GRHL2多克隆抗体，稀释度为1∶200)，4 ℃过夜孵育，第2天二抗溶液室温下孵育，DAB显色后冲洗。苏木素复染、1%盐酸分化，氨水反蓝。梯度酒精中脱水，二甲苯中透明，中性树脂封片，并于显微镜下观察。以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.9 Western Blot检测GRHL2，E-cadherin，α-SMA，vimentin，β-catenin，LEF1及MMP7蛋白表达

取石蜡肺组织标本匀浆，加入RIPA裂解液裂解，离心收集上清液就是总蛋白。BCA试剂盒测定蛋白浓度。制作浓缩胶，分离胶，室温水封静置30 min。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，后湿法转膜。一抗溶液(兔抗GRHL2多克隆抗体，兔抗E-cadherin，α-SMA，vimentin，β-catenin，LEF1及MMP7单克隆抗体，大鼠抗GAPDH单克隆抗体，稀释度均为1∶100)孵育，4 ℃过夜；次日于二抗溶液室温孵育1 h。于凝胶成像系统中曝光。

1.10统计学分析

2 结果

2.1各组大鼠肺组织HE染色结果

HE染色结果：正常对照组肺泡结构正常，无炎性细胞浸润；模型组肺泡结构被破坏，大量炎性细胞浸润，丙戊酸钠组肺组织结构较为完整，肺泡腔还存在，炎性细胞浸润较少。见图1。

2.2各组大鼠肺组织Masson染色结果及染色面积比的测定

Masson染色结果显示：正常对照组几乎不见蓝色胶原纤维沉积；模型组可见大量胶原纤维沉积，丙戊酸钠组胶原纤维沉积程度较轻。同时定量结果表明：与正常对照组比较，模型组染色面积比显著提高(P<0.01)；与模型组比较，丙戊酸钠组染色面积比显著降低(P<0.01)。见图2及图3。

*P<0.01，与正常对照组比较；#P<0.01，与模型组比较。

2.3各组大鼠肺组织HYP含量及Ashcroft评分的测定

与正常对照组比较，模型组中HYP含量及Ashcroft评分显著提高(P<0.01)；与模型组比较，丙戊酸钠组HYP含量及Ashcroft评分显著降低(P<0.01)。见图4。

*P<0.01，与正常对照组比较；#P<0.01，与模型组比较。

2.4各组大鼠肺组织中GRHL2的表达

与正常对照组比较，模型组中GRHL2阳性率及蛋白表达量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，丙戊酸钠组GRHL2阳性率及蛋白表达量显著提高(P<0.01)。见图5及图6。

*P<0.01，与正常对照组比较；#P<0.01，与模型组比较。

2.5各组大鼠肺组织中E-cadherin，α-SMA及vimentin蛋白的表达

与正常对照组比较，模型组中E-cadherin表达量下调，α-SMA及vimentin表达量上调(P<0.01)；与模型组比较，丙戊酸钠组E-cadherin表达量上调，α-SMA及vimentin表达量下调(P<0.01)。见图7。

2.6各组大鼠肺组织中β-catenin，LEF1及MMP7的表达

与正常对照组比较，模型组中β-catenin，LEF1及MMP7表达量显著上调(P<0.01)；与模型组比较，丙戊酸钠组β-catenin，LEF1及MMP7表达量显著下调(P<0.01)。见图8。

3 讨论

EMT是研究肺纤维化最为经典的方式之一，2型EMT与肺纤维化的发生发展密切相关。在组织器官缺氧，遭受炎症作用后，组织上皮失去了极性，细胞之间的黏附能力降低，细胞形态向纺锤型转变，逐渐丧失了上皮形态并具有了间质细胞的特性，此过程EMT上皮标记物如E-cadherin表达量下调，间质标记物α-SMA，vimentin表达量上调，促使细胞骨架发生重组向间质细胞转变，同时使细胞具有迁移运动能力。在上皮间质转化过程中涉及多种信号通路，Wnt/β-catenin信号通路是其中一种，并处于异常激活的状态[3-4]。Wnt/β-catenin信号通路参与细胞增殖，分化，凋亡等生物学过程，在支气管上皮肺泡的再生及EMT过程中发挥着重要作用[4,11-12]。其核心蛋白β-catenin是黏附分子/连环蛋白(cadherin/catenin)重要组成成分，能够与E-cadherin相互作用，维持着上皮细胞正常形态结构及连接，而在E-cadhein表达缺失或下调情况下，β-catenin被释放出来，在细胞浆中积累并进入细胞核，与转录因子T细胞因子(TCF)/淋巴样增强结合因子(LEF)结合形成复合物，调控靶基因的转录，如MMPs，MDR等蛋白的表达，进而促进EMT的发生[4,11-12]。因此通过阻断Wnt/β-catenin信号通路，继而扭转EMT的发生已逐渐成为肺纤维化治疗的靶点之一。

GRHL包括GRHL1，GRHL2，GRHL3三种亚型，其中GRHL2是2002年Wilanowski等[6]学者发现的一种类似于果蝇粒状头样的转录因，在维持上皮细胞的形态，黏附等结构功能方面起着重要作用。GRHL2能够维持着人正常肺泡上皮细胞的完整性，且Varma等[7]研究还证实GRHL2不仅能够表达于早期胚胎时期的人正常肺间质，还能够表达于特发性肺纤维化间质，但是表达量下调。同时GRHL2在博来霉素诱导的HPS1及HPS2小鼠特异性肺纤维化损伤中的间质中及化疗诱导的小鼠肺纤维化间质中的表达具有差异性。另外还有学者证实GRHL2表达量降低能够通过下调E-cadherin表达，继而促进vimentin的表达，促使EMT的产生[8-9]。而E-cadherin表达的下调与Wnt/β-catenin信号通路的激活具有相关性[4-5,12]。进而提示GRHL2可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路进而影响EMT的生成最终参与肺纤维化的发展，因此以GRHL2为靶点，通过构建慢病毒转染GRHL2继而探讨GRHL2在肺纤维化进程中作用对于肺纤维化的治疗将具有重要意义。但是慢病毒构建复杂且不合适临床应用，因此本研究将利用药物代替进行间接的探讨GRHL2在肺纤维化上皮间质转化中的作用及机制。

丙戊酸钠是一种组蛋白去乙酰基转移酶抑制剂，能够通过抑制组蛋白去乙酰化酶(HDACs)继而促使组蛋白过度的乙酰化，参与多种基因的转录调控。HADCs能够结合于E-cadherin启动子，继而使得组蛋白去乙酰化，丙戊酸钠通过抑制HADCs表达，继而阻断TGF-β1诱导的A549细胞的EMT生成[13]。另外有研究还证实丙戊酸钠能够通过下调α-SMA表达，上调E-cadherin表达，继而减轻博来霉素诱导的大鼠肺纤维化[10]。但是丙戊酸钠是否能够通过Wnt/β-catenin信号通路减轻大鼠肺纤维化及GRHL2在其中所起的作用如何尚未可知，因此本研究将对此展开研究。

博来霉素经气管内注射是目前构建动物肺纤维化模型最为常用的诱导剂，其诱发的动物模型肺组织病理变化与人肺纤维化病理特点一致，且操作较为方便，造模成功率高[14-15]。因此本研究首先参考相关文献[14-15]并利用预实验采用5 mg/kg的博来霉素来构建大鼠肺纤维化模型，在28 d时HE染色，Masson染色及HYP含量的测定结果均证实本研究所构建的大鼠肺纤维化模型均已成功。接着探讨丙戊酸钠对大鼠肺纤维化的抑制作用及GRHL2在大鼠肺纤维化EMT中的作用。HE染色，Masson染色及HYP含量表明丙戊酸钠能显著的改善模型大鼠肺细胞结构，减轻胶原纤维的沉积，降低HYP含量，说明丙戊酸钠对大鼠肺纤维化具有治疗作用，与高淑艳等[10]研究一致。进一步利用免疫组化探讨GRHL2在模型大鼠肺组织中的表达，结果表明模型组中GRHL2阳性率显著低于正常组，与Varma等[7]研究一致，而丙戊酸钠组GRHL2阳性率显著高于模型组，此结果在后续的western blot研究中进一步得到证实，从而说明GRHL2在大鼠肺纤维化中含量减少，而当GRHL2表达量上调后，大鼠肺纤维化进程被抑制，且丙戊酸钠对大鼠肺纤维化的减轻作用与调控GRHL2表达有关。然后本研究继续利用western blot检测各组大鼠肺组织中EMT相关蛋白的表达，结果表明与模型组比较，丙戊酸钠组肺组织中E-cadherin表达量上调，α-SMA及vimentin下调，说明丙戊酸钠通过抑制EMT的形成，减轻大鼠肺纤维化，进一步推测GRHL2表达量的提高可通过阻断EMT的发生，阻止大鼠肺纤维化的发展。最后本研究探讨GRHL2，丙戊酸钠与Wnt/β-catenin信号通路的关系，结果证实丙戊酸钠组中β-catenin，LEF1及MMP7表达量显著低于模型组，从而说明丙戊酸钠通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，继而阻止EMT的产生，达到减轻大鼠肺纤维化的过程，进一步推测GRHL2表达量上调后通过阻断Wnt/β-catenin信号通路，继而抑制EMT的形成，最终阻止大鼠肺纤维化的进一步发展。

综上所述，在大鼠肺纤维化过程中GRHL2表达量下调，进而激活Wnt/β-catenin信号通路，促进EMT的发生，加剧大鼠肺纤维化程度，而丙戊酸钠能够通过上调GRHL2表达，阻断Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制EMT的形成，最终减轻大鼠肺纤维化。

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ResearchofGRHL2inepithelialmesenchymaltransitionofpulmonaryfibrosis

SUN Jian,DAI Wen-jing,QIU Jing,LI Wan-cheng

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,Sichuan,China)

Objective：To explore the function of grainyheas-like2 (GRHL2) on the epithelial-mesenchymal transition (EMT) in pulmonary fibrosis rats.Methods45 rats were randomly divided into normal control group,model group and sodium valproate group,15 rats in each group.Rats in the model group and sodium valproate group were injected with bleomycin along air tube to construct pulmonary fibrosis model,and rats in the normal control group was given the same amount of normal saline by the same method.The rats were injected with 200 mg·kg-1·d-1sodium valproate by intraperitoneally in sodium valproate group,the rats were injected with the same amount of normal saline in the normal control group and the model group for 28 d continuously.The pathological changes of lung tissue was detected by HE staining.The fibrosis of lung tissue was detected by Masson staining.The content of hydroxyproline (HYP) was detected by alkaline hydrolysis.The expression of GRHL2 was detected by immunohistochemistry and Western blot.The expression of EMT related protein E-cadherin,alpha smooth muscle cell actin (α-SMA),Vimentin,Wnt/β-catenin signaling pathway related proteins was detected by Western blot.ResultsCompared with the normal control group,the alveolar structure of lung tissue was destroyed,a large number of collagen fibers were deposited,the collagen staining area ratio,Ashcroft score and HYP content were increased (P<0.01),the positive rate and expression of GRHL2 was decreased (P<0.01),the expression of E-cadherin was down-regulated (P<0.01),the expression of α-SMA,Vimentin,β-catenin,lymphoid enhancer-binding (LEF1) and matrix metalloproteinase 7 (MMP7) up-regulated in model group(P<0.01).Compared with the model group,the structure of alveolar tissue was more complete,the degree of collagen fiber deposition was lighter,the collagen staining area ratio,Ashcroft score and HYP content decreased (P<0.01),the positive rate and expression of GRHL2 was increased (P<0.01),the expression of E-cadherin was up-regulated (P<0.01),the expression of α-SMA,Vimentin,β-catenin,LEF1 and MMP7 down-regulated (P<0.01).ConclusionIn rats with pulmonary fibrosis,the expression of GRHL2 is down regulated,which activates the Wnt/beta-catenin signaling pathway,promotes the formation of EMT and aggravates the pulmonary fibrosis in rats,and valproate can reverse the process.

Grainyheas-like2 (GRHL2);Sodium valproate;Pulmonary fibrosis;Rats;Epithelial-mesenchymal transition (EMT);Wnt/β-catenin signaling pathway

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.001

四川省教育厅科研计划项目(16ZB0292)

2017-06-01

孙建(1981-)，男，硕士，副主任医师。E-mail：xuerl61@126.com

李万成，E-mail：xuerl61@126.com

时间： 2017-10-10 02∶27

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0227.004.html

1005-3697(2017)05-0650-06

R563

A

(学术编辑陈小菊)

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