绵羊成纤维细胞中TALE-TFs激活β酪蛋白基因启动子研究

皮文辉

绵羊成纤维细胞中TALE-TFs激活β酪蛋白基因启动子研究

皮文辉

（绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆 石河子 832000）

针对绵羊 β-酪蛋白基因启动子序列设计4个人工转录因子TALE-TFs（Transcription activator-like Biffectortranscription factors）。电转染TALE-TFs进入绵羊成纤维细胞中，通过实时荧光定量和Western blotting检测β-酪蛋白基因表达，筛选获得激活效果较好的TALE-TF1。将TALE-TF1和β-酪蛋白基因启动子、Red报告基因质粒电转染进入绵羊成纤维细胞，通过荧光显微镜直接观察报告基因Red表达。研究表明，利用TALE人工转录因子，在绵羊成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框，为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了一种检测途径。

TALE-TFs；绵羊成纤维细胞；β-酪蛋白基因启动子；表达调控

0 引言

1987年，Gordon等采用原核显微注射转基因技术获得乳腺生物反应器小鼠模型[1]。随着转基因技术体系的发展，在哺乳动物基因组的高表达乳蛋白基因座，定位整合外源基因，利用乳蛋白基因固有的转录翻译机制，调控外源整合基因表达，可能成为构建乳腺生物反应器模型的一种途径[2-4]。

哺乳动物β-酪蛋白基因在乳腺中高表达[5，6]，皮肤[7]和有毒 T淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocytes）[8]中也有所表达。敲除β-酪蛋白基因小鼠能够正常生长、繁殖和哺育后代[9]。乳腺中外源基因直接代替内源基因，可提高外源基因表达竞争能力[10]。因此，β-酪蛋白基因位点是制备乳腺生物反应器的合适靶点。

为证实β-酪蛋白基因启动子驱动的表达框是有效的，Kolb等采用乳腺上皮细胞进行了研究[2]。国内乳腺生物反应器研究方面，也采用乳腺上皮细胞验证表达框的有效性[11，12]。如果能够在成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子，检测重组表达框的表达结果，将为乳腺生物反应器的构建提供方便的检测技术。

转录激活样效应子 （transcription activator-like effector，TALE）来源于黄单胞杆菌（Xanthomonas sp.），TALE-DNA结合结构域由串联重复单元组成，大部分单元含34（33—35）个氨基酸，单元的第12和13位氨基酸高度可变，称为重复可变区（repeat vari ablediresidues，RVDs）。TALE 的 RVDs识别 DNA 序列的4个碱基具有高度的专一性，TALE重复单元的第13位氨基酸直接与DNA的碱基特异结合[13-15]。研究者开发的模块化构建程序[16]，几乎能够针对任何DNA靶序列，构建特异性TALE-DNA结合域，成就TALEs作为基因组编辑（genome editing）和基因转录调控（transcriptional modulation）的有效工具，也是动物基因组相关研究的有力工具[16-18]。

TALE-DNA结合域串联VP64转录激活因子，构成 TALE转录因子 （TALE transcription factors，TALE-TFs）。TALE特异结合DNA，VP64同真核细胞内转录因子作用，招募RNA聚合酶和其它因子，稳定转录前起始复合体 （transcription preinitiation complex），间接调控特定基因转录[16]。

TALE-TFs即能提高表达基因的转录水平，还能激活在特定细胞中不表达的基因。本文将含绵羊β-酪蛋白基因5'端启动子的红色荧光蛋白报告基因质粒，与TALE-TFs共转染绵羊胚胎成纤维细胞，观察到红色荧光蛋白 （red fluorescent protein，Red）表达，证实在成纤维细胞中，TALE-TFs能激活质粒上的β—酪蛋白基因启动子。反转录PCR和荧光实时定量PCR实验，证实TALE-TFs激活了绵羊成纤维细胞中的β-酪蛋白基因。说明能够用TALETFs，在绵羊的成纤维细胞中，检测重组的β-酪蛋白基因启动子—外源基因表达框的转录结果，为乳腺生物反应器构建，提供一种新的筛选核供体细胞的检测技术方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DH5α菌种购自Invitrogen公司，pMD18-T购自 TaKaRa公司，pDsRed2-1和 pEFGFP-N1购自Clontech公司。TALE-TFs由广州复能基因有限公司构建。绵羊胚胎成纤维细胞由本实验室原代培养保存。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank中绵羊β-酪蛋白基因序列（X79703.1）和 GAPDH 基因序列（NM_001289746.1）设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表1。

表1 引物名称及序列Table 1 PCR primer design and sequences

1.2.2 基因片段扩增和克隆

药物治疗管理 （medication therapy management，MTM）是指由具有MTM资质的医护人员（主要是药师），单独或通过调适药物来优化患者个体医疗结果的特殊服务。合格的药师在MTM服务中有着独一无二的地位[4]，是MTM的主要提供者。本文作者通过使用 “COPD，Drug-related problems，Medication therapy management，Pharmaceutical care，Pharmaceutical service”等关键词，检索COPD MTM服务相关文献，总结COPD患者存在的常见DRPs及MTM工作模式在COPD疾病中运用的情况。

以绵羊基因组为模版，ShE1F和ShE2R为引物，PCR扩增获得4 580 bp DNA片段I。以DNA片段I为模版，用引物TYShE1LBF/TYGDShE1LBR和TYShE1RBF/TYShE1RBR扩增，获得绵羊β酪蛋白基因第一外显子靶点的同源重组左臂DNA片段2和右臂DNA片段3。采用XhoI和HindIII双酶切片段2和pDS-Red2-1质粒，T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，获得过度载体pDS-Red-GDLB。为了将绵羊β酪蛋白基因完整的信号肽拼接在一起，将ShE2-Oli1/ShE2-Oli2退火复性，获得含4个碱基粘性末端的DNA片段。用HindIII/BsmBI酶切pDS-Red-GDLB载体，胶回收DNA片段，并将该片段同ShE2-Oli1/ShE2-Oli2退火复性片段经T4连接酶连接，获得pDS-Red-ShE1LB载体。应用HindIII/MnuI双酶切右臂DNA片段3和pDS-RED-ShE1LB载体，胶回收DNA片段，T4连接酶连接对应片段，获得pTY-ShE1LB-2BsmBIShE1RB。

以DNA片段I为模版，用引物TYShE1LBF/TYShE2LBR和TYShE2RBF/TYShE2RBR扩增，获得绵羊β酪蛋白基因第二外显子靶点的同源重组左臂DNA片段4和右臂DNA片段5。采用XhoI和HindIII双酶切片段4和pDS-Red2-1质粒，胶回收DNA片段，T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，获得载体pDS-Red-ShE2LB。应用HindIII/AflII双酶切右臂DNA片段3和pDS-REDShE2LB载体，胶回收DNA片段，T4连接酶连接对应片段，获得载体pTY-ShE2LB-2BsmBI-ShE2RB。

模板采用 pDS-Red 2-1质粒，TYShRedF/TYShRedR引物PCR扩增，获得红色荧光蛋白Red+poly A基因片段。BsmBI酶切Red+poly A基因片段、pTY-ShE1LB-2BsmBI-ShE1RB载体和 pTYShE2LB-2BsmBI-ShE2RB载体。胶回收相应基因片段。T4连接酶连接Red+poly A基因片段和pTYShE1LB-2BsmBI-ShE1RB载体，获得pShE1lBRed-pA-ShE1RB报告基因表达载体（图1）。T4连接酶连接Red+poly A基因片段和pTY-ShE2LB-2BsmBI-ShE2RB载体，获得pShE2LB-Red-pAShE2RB报告基因表达载体（图2）。

载体构建过程中，涉及到的PCR扩增DNA片段，全部采用TAKARA公司的高保真PrimeSTAR R Max DNA Polymerase（R050A），PCR 扩增程序：98 ℃10 s；55 ℃ 10 s；72 ℃ 10 s；35 个循环。

载体构建过程中，涉及到连接DNA片段，全部采用TAKARA公司T4 DNA连接酶 （2011A），10μL连接体系，16℃过夜连接。将5μL连接液加入50 μL DH5a大肠杆菌感受态中，30 min冰浴，42℃热击90s，冰浴3 min，涂于含卡纳抗性的固体琼脂糖平板，37℃培养14—16 h。挑取单克隆接种于含卡纳抗性的LB液体培养基中，37℃200 rpm的摇床中培养12 h，菌体裂解提质粒。载体序列测定由Invit rogen公司完成。

1.2.3 TALE-TFs靶点设计

以绵羊β-酪蛋白基因序列（X79703.1）和TALE（转录激活样效应子）单元与DNA碱基配对关系为基础，分析设计TALE-TFs（转录激活样效应子—人工转录因子）靶点序列（图3）。

1.2.4 绵羊胚胎成纤维细胞传代培养

图3 绵羊β-酪蛋白基因人工转录因子靶点序列示意图Figure 3 Target sites of engineered TALE transcript factors in the ovineβ-casein gene

选择妊娠30日龄的中国美利奴军垦型细毛羊胎羊，取肌肉组织剪切成小块，按0.5 cm间距均匀种植于培养皿，待组织小块贴壁，加入培养液（Gibco公司的DMEM高糖培养液+15%血清+1%双抗），置于37℃、5%CO2和完全饱和湿度条件下培养。3—4d换液1次，待原代细胞汇合成片，占培养皿的80%—90%时，进行传代培养，获得绵羊胚胎成纤维细胞。收获细胞用Gibco胰酶替代物TrypLE消化，室温2 500 r离心5 min，收集绵羊胚胎成纤维细胞。

1.2.5 绵羊胚胎成纤维细胞电转染质粒

电转液用纯水配制。 SolutionⅠ（10mL）：2g ATPNa2和 1.2 g MgCl2·6H2O；SolutionⅡ （500 mL）：6 g KH2PO4、0.6 g NaHCO3和 0.2 g C6H12O6。 加 SolutionⅠ，使用0.2μm滤器过滤除菌，-20℃保存；SolutionⅡ用NaOH调节pH值到7.2，0.2μm滤器过滤除菌，4℃保存；用时将SolutionⅠ和SolutionⅡ按照1∶50体积比混合。

待细胞生长至培养皿的80%时，消化收集1.8×106个细胞，100μL 电转液悬浮（S1∶S2=1∶50）， 按各2.5μg加入除内毒素的TALE-TF质粒和红色荧光蛋白报告基因表达质粒pShE1lB-Red-pAShE1RB或者pShE2lB-Red-pA-ShE2RB，混匀转入电击杯中。电转染阳性对照采用pMax质粒，5μg每100μL电转液，检测转染效率用流式细胞仪。选择CZ-165电转程序，对绵羊胚胎成纤维细胞实施电转。静置10 min，加入含15%胎牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，将电转染后的绵羊胚胎成纤维细胞转入6孔培养板，37℃、5.0%CO2和饱和湿度条件培养，6 h后换培养液1次。电转细胞48 h观察细胞荧光蛋白基因表达效果。

1.2.6 qRT-PCR

Trizol（15596-026， invitrogen）试剂提取细胞总RNA。cDNA的制备按照EasyScript试剂盒说明操作（AT314，北京全式金生物技术有限公司）。反应结束后cDNA保存于-20℃。选用GAPDH为内参基因，以ShbetaRTF/ShbetaRTR和ShGAPDHF/ShGAPDHR为引物，根据实时荧光定量PCR试剂盒说明操作，扩增β-酪蛋白和GAPDH基因。qRT-PCR反应体系为 20μL，包括：2×qPCRMix 10μL，上下游引物各0.4μL，模板 cDNA 1μL，去离子水 8.2μL。 扩增条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃5 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，在72℃20 s处收集荧光信号，共45个循环；扩增反应结束后，以0.1℃/s的速度进行溶解曲线分析。荧光定量 PCR数据分析采用 2-ΔΔCt法， 计算不同TALE-TFs电转染后对绵羊胚胎成纤维细胞β-酪蛋白基因mRNA表达量的影响。

1.2.7 Western blotting

电转染细胞培养至72 h，收集细胞，用哺乳动物蛋白（康为世纪）抽提试剂提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量，调整蛋白浓度，煮沸变性5 min，12%SDSPAGE电泳后转印至PVDF膜，5%BSA溶液4℃过夜封闭，1∶1 000稀释的 Beta-Casein抗体（AB BIOTEC，250558），室温孵育 4 h；1 ∶5 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（CW0103，康为世纪），室温孵育1.5 h；洗膜后化学发光显色。内参对照为GAPDH。

1.2.8 流式细胞检测

电转染细胞后，培养至48—72 h，使用荧光显微镜观察成纤维细胞GFP和RFP（red fluorescent pro tein，RFP）表达。细胞培养72 h，收集细胞。重悬在0.5 mL的PBS中，流式细胞仪分析（BDFACSAriaⅢ，FACSDiva Version 6.1.3）。FITC通道检测绿色荧光细胞。每份样品细胞计数10 000个。

2 结果与分析

2.1 绵羊成纤维细胞转染效率

流式细胞仪检测结果显示，pMax质粒转染效率达93.8%（图4）。说明实验选择的CZ-165电转程序能够满足绵羊胚胎成纤维细胞电转染后继实验。

2.2 TALE-TFs激活绵羊成纤维细胞β-酪蛋白基因结果

TALE-TFs 4个人工转录因子分别电转染进入绵羊成纤维细胞，培养72 h后提取总RNA，GAPDH做内参，实时荧光定量PCR分析TALE-TFs激活绵羊β-酪蛋白基因转录效率，结果见图5。图6是绵羊成纤维细胞电转染单个转录因子TALE-TF1、两个转录因子TALE-TF1和TALE-TF2共转染、细胞的Western blotting检测图。

荧光定量PCR结果表明，在绵羊成纤维细胞中，TALE-TF1激活β-酪蛋白基因转录效率较高。Western blotting结果进一步确定，TALE-TF1能够在绵羊成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因转录，并完成翻译过程。

2.3 TALE-TF1激活Red报告基因质粒结果

为了确定TALE-TF1人工转录因子能否激活β-酪蛋白基因启动子表达载体，将TALE-TF1和Red报告基因质粒pShE1lB-Red-pA-ShE1RB或pShE2lB-Red-pA-ShE2RB共同转染进绵羊成纤维细胞。电转染36 h时能够观察到绿色荧光报告基因，说明4个人工转录因子都正常表达。72 h和96 h时，均能够观察到红色荧光蛋白表达（图7），说明在绵羊成纤维细胞中，TALE-TF1人工转录因子能够激活β-酪蛋白基因启动子调控的目的基因质粒。

3 讨论

根据TALE-DNA结合分子密码，针对基因组靶位点设计TALEs，不同的TALEs具有不同的活性，可能与上下文依赖效应或染色体状态有关[19]。为了在绵羊成纤维细胞中得到具有一定活性的TALETF，构建多个TALE-TFs，转染体外培养绵羊成纤维细胞，筛选有生物学活性的TALE-TFs，能够解决TALEs靶向局限性。本文针对绵羊β-酪蛋白基因启动子序列，设计构建了4条TALE-TFs，获得了1条激活效率较高的TALE-TF1人工转录因子。研究表明，TALE-TF1能够激活内源和外源β-酪蛋白基因启动子，利用TALE-TF能够在绵羊成纤维细胞中进行检测β-酪蛋白基因启动子—外源基因表达框是否能够正常表达，为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了一种新的检测途径。

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Activation ofβ-casein Gene Promoter By Using Engineered TALE-TFs in Ovine Fibroblasts

PIWen-hui
（State Key Laboratory for Sheep Genetic Improvement and Healthy Production， Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences， Shihezi832000， Xinjiang）

Four TALE-TFs targeting promoter of ovineβ-casein gene were designed and TALE-TFs of eukaryotic expression plasmid were constructed.These TALE-TFs plasmids were nucleofected into sheep embryo fibroblasts respectively.Compared with the controlgroups,TALE-TF1wasidentifiedtoeffectivelyactivatetheexpressionofsheepβ-caseingenethroughqRT-PCRand Westernblotting.TALE-TF1plasmidandexpressioncassettewithβ-caseingenepromoterand Redfluorescentproteinreportergenewereco-nucleofected into ovine fibroblasts through Amaxa Nucleofector.β-casein gene promoter could be activated by artificial TALE-TFs in ovine fibroblasts.TALE-TFs were adopted to provide a new approach for detecting the expression result ofβ-casein gene promoter interesting gene expression cassettesin ovine fibroblasts.

TALE-TFs； Ovine fibroblasts； β-casein gene promoter； Gene expression modulation

2017-06-07

兵团应用基础研究计划(2016AG008);国家自然科学基金项目(31560321，31360276)

联系方式：皮文辉(1972-),男,研究员,研究方向动物遗传育种,Emai l:wzj pwh@163.com