复发性流产患者血清维生素D水平与自身免疫抗体、淋巴细胞亚群的关系研究

贾新转 ，郭丽娜 ，李玉琢 ，王叶 ，魏兰

（1.河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050011；2.河北省胸科医院，河北 石家庄 050041）

复发性流产患者血清维生素D水平与自身免疫抗体、淋巴细胞亚群的关系研究

贾新转1，郭丽娜1，李玉琢2，王叶1，魏兰2

（1.河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050011；2.河北省胸科医院，河北 石家庄 050041）

目的探讨复发性流产（RSA）患者血清维生素D水平与自身免疫抗体、淋巴细胞亚群的关系。方法回顾性分析RSA患者125例，根据血清25羟维生素D[25（OH）D]水平，分为25（OH）D正常水平组50例、25（OH）D低水平组75例，分析两组自身免疫抗体阳性率及淋巴细胞亚群水平。结果25（OH）D低水平组抗心磷脂抗体（ACA）、抗核抗体（ANA）的阳性率及甲状腺过氧化物酶（TPO）抗体阳性率均高于25（OH）D正常水平组，差异有统计学意义（P＜0.05）；25（OH）D 低水平组外周血 CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD19+及 CD56+百分率均高于25（OH）D正常水平组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论RSA患者中维生素D缺乏的比例较高，维生素D缺乏的RSA患者ACA、ANA及TPO抗体阳性率较高，RSA维生素D水平与CD4+T细胞、B细胞及NK细胞免疫平衡有关。

复发性流产；维生素D；T淋巴细胞；B淋巴细胞；NK细胞

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指连续≥3次的自然流产，在孕龄女性中的发病率为1%～3%[1]，目前证实免疫失衡与RSA有关。近年来研究发现维生素D作为胚胎种植中免疫调节因子，在生殖中发挥重要作用[2]，维生素D充足与体外受精（in vitro fertilization，IVF）妊娠率提高相关[3]。但关于维生素D在RSA中作用的研究较少。本研究旨在探讨RSA患者血清维生素D水平与自身免疫抗体、淋巴细胞亚群的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016年6月-2016年9月在本院生殖中心就诊的RSA患者125例作为研究对象，年龄25～32岁。入组标准：①夫妻双方染色体核型均正常；②盆腔彩超除外生殖道器质性病变；③宫颈分泌物检查除外生殖道感染；④生殖内分泌激素检查无异常，且无内分泌疾病史；⑤无血栓形成倾向或高凝状态；⑥月经周期规律，最近3个月内未应用内分泌或免疫调制剂及维生素D；⑦男方精液常规检查无异常。根据血清25（OH）D水平将研究对象分为维生素D正常水平组（25（OH）D≥30 ng/ml）、维生素 D 低水平组（25（OH）D＜30 ng/ml）。两组研究对象既往流产次数[25（OH）D低水平组既往流产3次49例（65.33%），既往流产≥4次 26例（34.67%），25（OH）D 正常水平组既往流产3次29例（58.00%），既往流产≥4次21 例（42.00%）（χ2=0.69，P=0.41）]差异无统计学意义（P＞0.05）。两组研究对象年龄、体重指数（body mass index，BMI）、月经周期及末次自然流产后的时间间隔差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

1.2 研究方法

研究对象均于月经周期第3天，抽取晨空腹静脉血3 ml（检测标本均为外周血）。

1.2.1 血清25（OH）D水平测定 应用JC028酶标仪（瑞士澳斯邦公司）酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测 25（OH）D 水平，按照 25（OH）D 试剂盒（英国IDS公司）说明进行操作。

1.2.2 自身免疫抗体检测 应用ELISA测定抗心磷脂抗体（anti cardiolipin antibody，ACA）、ACA-IgG及ACA-IgM。采用间接免疫荧光法测定抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）和免疫印迹法测定ANA谱（抗-dsDNA抗体、抗-ssDNA抗体、抗-组蛋白抗体及抗Scl70抗体）；应用化学发光免疫分析法测定甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）。TPOAb试剂盒购自美国Beckman公司，其余试剂盒购自德国欧蒙公司，所用仪器分别为JC028酶标仪，Eurolinescan自动判别软件（德国欧蒙公司），EUROBlotMaster分析仪荧光显微镜（德国欧蒙公司），DXI800型全自动化学发光免疫分析仪（美国Beckman公司）。

1.2.3 淋巴细胞亚群检测 采用流式细胞术测定淋巴 细 胞 亚 群 [CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD19+、CD56+]。所用试剂盒购自美国eBiascience公司，FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验或秩和检验，计数资料以率（%）表示，用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSA女性25（OH）D水平分组情况

125例 RSA 患者中，50例（40.00%）为 25（OH）D 正常水平（≥30 ng/ml），75例（60.00%）是 25（OH）D 低水平（＜30 ng/ml）。

2.2 两组自身免疫抗体阳性率的比较

25（OH）D低水平组ACA、ANA的阳性率及TPOAb阳性率均高于25（OH）D正常水平组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组 ACA-IgG、ACA-IgM、抗-dsDNA、抗-ssDNA、抗-组蛋白及抗Scl70阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 两组淋巴细胞亚群的比较

25（OH）D 低水平组外周血 CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD19+及 CD56+百分率均高于 25（OH）D 正常水平组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组CD3+及CD3+CD8+差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表1 两组基本情况的比较 （±s）

表1 两组基本情况的比较 （±s）

组别例数年龄/岁BMI/（kg/m2）月经周期/d末次自然流产后的时间间隔/月25（OH）D 低水平组 75 27.75±1.71 21.42±1.72 27.52±2.12 4.13±0.82 25（OH）D 正常水平组 50 27.46±1.97 21.16±1.75 26.68±2.30 4.12±0.79 t值 0.861 0.819 0.789 0.091 P值 0.391 0.414 0.481 0.928

表2 两组自身免疫抗体阳性率的比较 %

表3 两组淋巴细胞亚群的比较 （±s）

表3 两组淋巴细胞亚群的比较 （±s）

组别 例数 CD3+T/% CD3+CD4+T/% CD3+CD8+T/% CD4+/CD8+ CD19+/% CD56+/%25（OH）D 低水平组 75 74.48±3.02 42.12±3.79 25.52±2.34 1.65±0.04 10.65±1.60 13.23±3.07 25（OH）D 正常水平组 50 74.86±2.83 36.30±3.47 25.16±1.87 1.44±0.05 6.55±0.48 10.44±1.48 t/u值 0.706 8.687 1645.000 15.000 273.000 777.000 P值 0.481 0.000 0.243 0.000 0.000 0.000

3 讨论

近年来研究发现，维生素D参与钙磷代谢、机体免疫及生殖等生理过程[4]，维生素D是生殖成功过程中的一个关键因素[5]。大量流行病学调查发现维生素D缺乏在世界范围内普遍存在[6]。最近研究中显示，妊娠期女性同样普遍存在维生素D缺乏[7]。本研究发现在RSA患者中维生素D缺乏的比例较高。

本研究同时发现，RSA患者中25（OH）D低水平组ACA、ANA及TPO抗体的阳性率高于25（OH）D正常水平组，而两组IgG、IgM、抗-dsDNA、抗-ss-DNA、抗-组蛋白及抗Scl70抗体阳性率均无差异。本研究组前期研究提示TPOAb阳性与维生素D低水平密切相关，维生素D低水平、TPOAb阳性相互作用增加自然流产风险[8]，另有学者报道，维生素D水平与TPOAb定量负相关[9]。ROUSSEV等[10]报道抗磷脂抗体综合征的患者维生素D缺乏普遍性增加，维生素D缺乏与ACA、ANA及TPOAb增加相关。本研究结果与之相似，推测维生素D水平可影响RSA自身免疫抗体。有学者对维生素D水平如何影响自身抗体进行研究，证实维生素D缺乏与经B细胞活化的自身抗体增加相关[11]，维生素D通过抑制活化的B细胞增殖、诱导其凋亡，在自身抗体产生中起调节作用。在本研究中RSA患者25（OH）D低水平组外周血CD19+百分比高于25（OH）D正常水平组，推测维生素D通过调节B淋巴细胞增殖及功能影响自身免疫抗体，进而影响妊娠过程，其具体机制仍需进一步探讨。

在本研究中同时对RSA女性维生素D水平与T淋巴细胞、NK细胞的关系进行分析，结果显示，维生素D低水平组CD4+较维生素D正常水平组增多，CD4+/CD8+增高，但T细胞总数、CD8+均无差异。T淋巴细胞是机体内主要的免疫细胞，主要包括CD4+、CD8+。CD4+介导细胞免疫，其数量增多可使母体对胚胎发生较强的免疫排斥，引起流产。CD8+可抑制CD4+介导的免疫排斥，正常情况下两者达到平衡状态。反复流产患者外周血CD4+增多，而CD8+无变化[12]。体外试验证实维生素D可调控活化T细胞，促进其分化及免疫耐受[13]，维生素D可抑制Th1细胞增殖并限制其产生细胞因子（如IFN-r、IL-2及TNF-α），诱导 Th2细胞因子（如 IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10及 IL-13）[14]。而维生素 D 在RSA 患者体内如何调控T淋巴细胞有待于进一步研究。

NK细胞数量、功能异常是引起RSA的重要因素[15]，外周血NK细胞高水平能够预测下次妊娠仍有可能发生自然流产[16]。有研究报道，维生素D与NK细胞毒性呈负相关，体外实验进一步发现缺乏维生素D可抑制穿孔素分泌，进而影响对靶细胞的杀伤[7]。本研究结果显示，25（OH）D低水平组外周血CD56+百分比高于25（OH）D正常组，推测维生素D同时参与NK细胞数量和细胞毒性的调控。

综上所述，RSA患者中维生素D缺乏的比例较高，维生素D缺乏可影响RSA患者的免疫状态。维生素D低水平的RSA患者有ACA、ANA及TPOAb阳性的倾向，而ACA、ANA及TPOAb阳性与生殖失败相关。RSA患者维生素D水平与CD4+、B细胞及NK细胞免疫平衡有关。对于维生素D缺乏的RSA患者添加维生素D治疗是否可改善生殖状况有待于进一步研究。

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Study on relationship between serum vitamin D level and autoantibodies or lymphocyte subsets in patients with RSA

Xin-zhuan Jia1,Li-na Guo1,Yu-zhuo Li2,Ye Wang1,Lan Wei2
(1.Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050011,China;2.Hebei Chest Hospital,Shijiazhuang,Hebei 050041,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between serum vitamin D level and autoantibodies or lymphocyte subsets in patients with recurrent spontaneous abortion (RSA).MethodsA total of 125 patients with RSA were included in a retrospective analysis.According to the serum levels of 25-hydroxy vitamin D[25-(OH)-D],the patients were divided into[25-(OH)-D]normal group including 50 cases and[25-(OH)-D]low level group including 75 cases.The positive rate of autoantibodies and the level of lymphocyte subsets in the two groups were analyzed.ResultsCompared with the [25-(OH)-D]normal group,the positive rates of anticardiolipin antibody(ACA),antinuclear antibody(ANA)and thyroid peroxidase(TPO)antibody were higher in the [25-(OH)-D]low level group,the difference was statistically significant(P＜0.05);the percentages of(CD3+/CD4+)T,CD4+/CD8+,CD19+B cells and CD56+natural killer(NK)cells were higher in the[25-(OH)-D]low level group,the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionsThe rate of vitamin D deficiency is higher in women with RSA.The positive rates of ACA,ANA and TPO are higher in RSA women with vitamin D deficiency.The vitamin D level in women with RSA is related to CD4+T cells,B lymphocytes and the balance of NK cells.

recurrent spontaneous abortion;vitamin D;T lymphocyte;B lymphocyte;NK cell

R71

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.014

1005-8982（2017）24-0066-04

2017-03-16

魏兰，E-mail：1134979643@qq.com

（唐勇 编辑）