二氢杨梅素对裸鼠腹腔移植人胃癌细胞中Caveolin-1表达的影响*

王佑权，张帆，周寿红

（1.南华大学附属第二医院 肿瘤外科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学医学院生理学教研室，湖南 衡阳 421001）

二氢杨梅素对裸鼠腹腔移植人胃癌细胞中Caveolin-1表达的影响*

王佑权1，张帆1，周寿红2

（1.南华大学附属第二医院 肿瘤外科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学医学院生理学教研室，湖南 衡阳 421001）

目的观察二氢杨梅素（DMY）对裸鼠腹腔移植人胃癌细胞生长的抑制作用及对腹腔瘤组织中Caveolin-1表达的影响。方法复制人胃癌腹腔移植的裸鼠模型。将复模成功的24只裸鼠随机分为4组，即移植瘤模型组，DMY低、中及高剂量处理组。分别观察荷瘤裸鼠的腹腔移植瘤的生长和成瘤情况，测量肿瘤的重量、长短径并计算肿瘤的体积。采用免疫组织化学法和Western blot检测人胃癌腹腔移植瘤腹腔瘤体中Caveolin-1和Ki67的表达。结果与移植瘤模型组比较，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高剂量组腹腔移植瘤成瘤个数，腹腔瘤体的重量及腹腔瘤体的体积均降低，呈现剂量依赖性（P＜0.05），裸鼠的食欲、活动情况和精神状态等一般情况改善。与移植瘤模型组比较，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高剂量组腹腔移植瘤体表达Caveolin-1的阳性细胞百分率和Caveolin-1的蛋白表达水平均增加，呈现剂量依赖性（P＜0.05）；而Ki67的阳性细胞百分率和Caveolin-1的蛋白表达水平均降低，也呈现剂量依赖性（P＜0.05）。结论二氢杨梅素以剂量依赖的方式抑制人胃癌腹腔移植瘤的生长，其作用机制可能与上调Caveolin-1的表达有关。

二氢杨梅素；胃癌；裸鼠；腹腔移植瘤；小凹蛋白-1

在我国每年约有36万人死于胃癌，占女性恶性肿瘤死因的第2位，男性的第3位[1]。胃癌的复发和转移是导致患者死亡的主要原因，进行过胃癌根治性术的患者，其5年生存率也只有30%左右[2]。因此，抑制胃癌浸润和转移是提高胃癌患者的生存率及生活质量的主要任务。然而目前，尽管在防治肿瘤转移的方面开展大量的研究，但效果仍然不理想。近年来，中医药肿瘤防治领域中作用和优势越来越受到人们的关注。藤茶是一种广泛分布于我国长江流域以南地区的药食两用植物，长期用作茶类植物和中草药。二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）是一种二氢黄酮醇类化合物，主要从藤茶茎叶中提取。DMY具有镇痛、抗炎、抗氧化、止咳及调节免疫功能等作用[3-4]。近年来的研究发现，DMY具有抗肿瘤的作用，研究显示DMY以剂量依赖的方式诱导肺癌细胞A549细胞的凋亡，下调Bcl-2的表达而上调Bax的表达[5]。研究发现，DMY[100 mg/（kg·d）]灌胃处理减少小鼠乳腺癌肺转移瘤的瘤重和转移灶的数量[6]。Caveolae-1是Caveolae的标志性蛋白，Caveolin-1通过磷酸化与去磷酸化的方式与基质金属蛋白酶、Paxilli和E-钙粘蛋白等信号分子产生相互作用，参与肿瘤细胞的黏附、增殖、凋亡及迁移等过程的调控[7-8]。研究显示，抑制Caveolin-1的表达可促进胃癌细胞的生长和增生[9]。因此，本研究拟观察DMY对裸鼠腹腔移植人胃癌细胞生长的抑制作用，并从Caveolin-1的角度探讨其可能的机制，为胃癌的的防治提供新的靶点和策略。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

人胃低分化黏液腺癌细胞株MGC-803细胞（由上海吉玛制药技术有限公司提供），DMY（购自成都曼斯特生物科技公司），DMEM细胞培养液和胎牛血清（购自Hyclone公司），免疫组织化学（免疫组织化学）染色试剂盒（购自北京博奥森生物技术有限公司），BCA蛋白定量试剂（购自Invitrogen公司），一抗兔抗人Caveolin-1单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗（购自美国Santa Cruz公司）。

1.2 实验动物

选取35只4周龄雄性裸鼠，体重16～18 g/只，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK（京）2015～0001，饲养于本校动物实验中心无特殊病原体（SPF）级实验室（许可证号：SYXK（湘）2010～0006）。

1.3 细胞培养与人胃癌裸鼠腹腔种植模型的复制

采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养人胃低分化黏液腺癌细胞株MGC-803细胞，在37℃、5%二氧化碳CO2的细胞培养箱中培养。取对数生长期的细胞，胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整密度为 5×107个 /ml，按 0.2 ml/只（约为 1×107个细胞）将细胞悬液注射到裸鼠的腹腔内，正常对照裸鼠组腹腔注射等量的生理盐水。操作完成后裸鼠均正常喂养。

1.4 实验分组及给药

将复模成功的裸鼠随机分为4组，即移植瘤模型组，DMY低、中及高剂量处理组，每组6只。接种后第18天开始药物处理，DMY低、中和高剂量分别按50、100和200 mg/（kg·d）灌胃给药。对照组裸鼠，给予相同体积的生理盐水灌胃处理。DMY组每天给药1次，连续30 d。观察并记录裸鼠的情况（外观、精神、饮食、活动情况和全身改变情况）以及裸鼠腹腔移植瘤生长情况。末次给药后7 d处死裸鼠。开腹解剖，取出腹腔瘤体，称量其重量，腹腔瘤体的长短径，计算腹腔瘤体的体积。计算抑瘤率=（移植瘤模型组的瘤重-处理组的瘤重）/移植瘤模型组的瘤重×100%。

1.5 HE染色和免疫组织化学检测

腹腔瘤体甲醇固定后进行石蜡切片和HE染色，光镜下观察形态学的变化。石蜡切片在脱蜡后，通过煮沸修复抗原，脱脂奶粉封闭，一抗（1∶200）孵育，在4℃条件下过夜。清洗后二抗孵育，在37℃30 min，DAB显色，镜下控制反应，及时终止反应。苏木素复染，烘干，透明，封片，显微镜下观察拍照记录结果。Image-Pro Plus图像分析系统测定光密度，进行半定量分析。

1.6 Western blot检测

取适量的腹腔瘤体放入碾钵中，加入蛋白裂解液，按试剂盒说明提取组织总蛋白。测定样本的蛋白浓度，2×SDS凝胶加样缓冲液溶解蛋白样本，煮沸。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜。PVDF膜用10%脱脂牛奶封闭非特异性抗原，在室温下孵育2 h。加入兔抗人Caveolin-1（1∶400）、Ki67 和 β-actin（1∶1000）的一抗，4℃下孵育过夜。清洗后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，4℃下继续孵育4 h。洗膜后用ECL法显色并曝光成像于X线，经显影、定影后，以β-actin作为内参照，应用凝胶图像分析软件对胶片扫描，分析目的蛋白的表达水平。

1.7 统计学方法

数据处理采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠的一般情况观察

在接种后15d，移植瘤模型组的裸鼠腹部可扪及瘤结节，随着时间的增长，扪及的瘤结节不断增大，30 d时就可用注射器从腹腔中抽出少量血性腹水，裸鼠的腹部隆起越来越明显，裸鼠的食欲明显减退、活动明显减少、出现精神萎靡和体重减轻等情况。将裸鼠解剖后观察到裸鼠腹腔内有明显血性腹水，肝周、肠系膜、网膜、横膈、腹膜、腹壁和盆腔等地方可见灰白色0.1～3.0 cm大小不等的肿瘤结节，质地较硬，结节与周围组织有粘连，部分出现坏死，表明肿瘤移植成功，腹腔移植成功率为100%。与移植瘤模型组比较，DMY中及高剂量处理组腹部可扪及瘤结节较小，30 d时不能从腹腔中抽出血性腹水，裸鼠腹部隆起较小，裸鼠食欲和活动情况正常，精神状态良好。而DMY低剂量处理组组与移植瘤模型组以上症状无差异。见图1、2。

2.2 DMY对人胃癌腹腔移植瘤生长的抑制作用

各组腹腔移植瘤成瘤个数、瘤体的重量和体积差异有统计学意义（F=53.763、34.192和 48.114，P=0.001、0.011和0.001）。与移植瘤模型组比较，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高剂量组腹腔移植瘤成瘤个数（t=3.751和 4.762，均P=0.001），瘤体的重量及体积均降低（均P＜0.05），呈现剂量依赖性。50mg/（kg·d）DMY低剂量组与移植瘤模型组成瘤个数（t=0.773，P=0.542），瘤体的重量（t=1.152，P=0.363）及最大瘤体的体积（t=1.041，P=0.413）均差异无统计学意义。50、100 和 200 mg/（kg·d）DMY 的抑瘤率分别为5.76%、38.43%和41.29%，提示高、中剂量的DMY对人胃癌腹腔移植瘤有抑制作用。见图3。

图1 各组裸鼠腹部外观

图2 各组裸鼠腹部解剖情况

2.3 DMY对人胃癌腹腔移植瘤瘤体中Ki67表达的影响

采用免疫组织化学和Western blot检测人胃癌腹腔移植瘤瘤体中Ki67的表达，各组表达Ki67的阳性细胞百分率的差异有统计学意义（F=24.632，P=0.001）。见图4A、B。与移植瘤模型组比较，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高剂量组腹腔移植瘤体表达Ki67的阳性细胞百分率降低，呈现剂量依赖性（均P＜0.05）。与移植瘤模型组比较，100和200mg/（kg·d）DMY中、高剂量组腹腔移植瘤体中Ki67的表达水平降低，呈现剂量依赖性（均P＜0.05）。见图4C、D。

2.4 DMY对人胃癌腹腔移植瘤瘤体中Caveolin-1表达的影响

采用免疫组织化学和Westernblot检测人胃癌腹腔移植瘤瘤体中Caveolin-1的表达，各组表达Caveolin-1的阳性细胞百分率的差异有统计学意义（F=32.541，P＜0.05）。见图 5A、B。与移植瘤模型组比较，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高剂量组腹腔移植瘤表达Caveolin-1的阳性细胞百分率增加（均P＜0.05），呈现剂量依赖性。与移植瘤模型组比较，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高剂量组腹腔移植瘤中Caveolin-1的表达水平增加（均P＜0.05），呈现剂量依赖性。见图5C、D。

图3 DMY对人胃癌腹腔移植瘤腹腔成瘤个数、瘤重和瘤体积的影响及肿瘤抑制率

图4 人胃癌腹腔移植瘤瘤体中Ki67的表达 （×400）

图5 人胃癌腹腔移植瘤瘤体中Caveolin-1的表达（×400）

3 讨论

随着社会和生活压力的增加以及饮食结构和环境的变化，胃癌的发病率一直居高不下，而发病的年龄呈现出年轻化的态势[10-11]。手术切除肿块依然是目前胃癌的主要治疗手段，但手术后有50%的患者在5年内出现复发或远处转移[12]。胃癌患者术后复发和转移的主要原因是术前已经存在于腹腔的微小转移灶和手术过程中产生的游离的癌细胞。因此提高胃癌患者的生存率和生存质量的关键是有效预防和及时治疗肿瘤的腹腔转移。

DMY是一种在藤茶中的含量较高的黄酮类化合物，也大量地存在于葡萄、杨梅和蔬菜中。DMY具有广泛的药理作用，近年来发现DMY具有抗肿瘤的功效。研究显示，DMY能升高肺癌细胞系AGZY-83-a细胞中Caspase-3的活性和钙离子浓度，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡[13]。DMY也抑制肝癌细胞系HepG2细胞的生长，诱导其细胞凋亡[14]。DMY还能抑制小鼠B16黑色素瘤细胞的增殖、高转移型乳腺癌MDA-MB-231细胞和胃癌细胞SGC-7901细胞的增殖[15-16]。DMY也能抑制在体肿瘤的生长，DMY能减少小鼠乳腺癌肺转移肿瘤的重量和肺转移灶的数量[6]。DMY能抑制人肺癌GLC 82裸鼠移植瘤和人肝癌Bel27402裸鼠移植瘤的生长[17]。本实验结果显示，中、高剂量DMY能改善裸鼠的食欲、活动情况和精神状态等一般情况，能降低裸鼠的腹腔移植瘤成瘤个数，腹腔瘤体的重量及腹腔瘤体的体积。本结果表明，DMY有抗胃癌腹腔转移作用，并可抑制胃癌腹腔转移瘤生的长。Ki67是一种核抗原，与细胞增殖特异性相关。静止期的细胞不表达Ki67，而增殖期细胞的细胞核中表达，常用来评估细胞的增殖水平。本研究结果也显示中、高剂量DMY降低裸鼠腹腔移植瘤体中表达Ki67的阳性细胞百分率和Ki67的蛋白表达水平，提示DMY可能是通过抑制胃癌细胞增殖，而发挥其抗胃癌效应的，但是其详细机制不清楚。

Caveolin-1是1个抑癌基因，通过磷酸化和去磷酸化的方式与很多信号分子发生相互作用，参与肿瘤细胞的黏附、增殖、凋亡和迁移等生物学行为的控制。研究显示，在肉瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中Caveolin-1的表达均降低[18]。非贴壁依赖性生长（anchorage-independent cell growth，AICG）是恶性转化的细胞及具有较强转移能力的肿瘤细胞的生长特征。具有AICG特征的细胞可表现为细胞伸展出片层伪足，生长过程中未接触性抑制，AICG与肿瘤侵袭和转移密切相关。研究发现，Caveolin-1高表达于人乳腺癌细胞中可以抑制其AICG的特性[19]。研究显示，在乳腺癌细胞中存在132位密码子突变，而将突变型Caveolin-1基因导入NIH 3T3细胞中，发现可使NIH 3T3细胞获得AICG的特性，细胞的侵袭能力也增强[20]。在本研究中结果显示，与移植瘤模型组比较，中、高剂量DMY组裸鼠腹腔移植瘤体中表达Caveolin-1的阳性细胞百分率和Caveolin-1的蛋白表达水平均增加，呈现剂量依赖性。

总之，本研究结果表明，二氢杨梅素以剂量依赖的方式抑制人胃癌腹腔移植瘤的生长，其作用机制可能与上调Caveolin-1的表达有关。

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Effect of Dihydromyricetin on caveolin-1 in nude mouse models of human gastric cancer*

You-quan Wang1,Fan Zhang1,Shou-hong Zhou2
(1.Department of Oncological Surgery,the Second Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Physiology,Medical College of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo investigate inhibitory effect of Dihydromyricetin (DMY)on the growth of gastric cancer and expression of caveolin-1 in nude mouse models of human gastric cancer.MethodsNude mouse models of peritoneal transplanted human gastric cancer was established.Twenty-four successfully transplanted nude mice were randomly divided into 4 groups:tumor group,tumor with low dose group[50 mg/（kg·d）],moderate dose group[100 mg/（kg·d）]and high dose group[200 mg/（kg·d）]of DMY.The growth rate and tumorsize were monitored.The expression levelsofcaveolin-1 and Ki67 so caveolin-1 lin 1 by Immunohistochemistry and Western blot.ResultsThe number,weight,and volume of tumors were significantly decreased in both tumor with moderate and high dose groups dose dependently when compared with the tumor group(P＜0.05).The appetite,activity and mental state of animals in the tumor with moderate and high dose groups were significantly improved in comparison with the tumor group.Immunohistochemistry and Western blot data indicated that the percentage of Caveolin-1 positive cells and expression level of proteinCaveolin-1 were significantly increased in the tumor with moderate and high dose groups when compared with the tumor group dose dependently (P＜0.05).Similarly,the percentage of Ki67 positive cells and expression level were significantly increased in the moderate and high dose groups when compared with the tumor group dose dependently (P＜0.05).ConclusionsDMY inhibits the growth of peritoneal transplanted human gastric cancer in dose dependent manner and the mechanism may be related to upregulation of Caveolin-1.

Dihydromyricetin;gastric cancer;nude mice;peritoneal transplantable tumor;Caveolin-1

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.003

1005-8982（2017）24-0011-06

2017-07-11

湖南省教育厅科研项目（No：11c1108）

周寿红，E-mail：zhoushouhong@126.com

（王荣兵 编辑）