NVP-BEZ235对人结肠癌细胞SW480体外增殖的抑制作用及其机制探讨

马善义，孙兆楼

安徽省宣城市中心医院肿瘤科(宣城242000)

NVP-BEZ235对人结肠癌细胞SW480体外增殖的抑制作用及其机制探讨

马善义，孙兆楼

安徽省宣城市中心医院肿瘤科(宣城242000)

目的：探讨NVP-BEZ235对人结直肠癌细胞株SW480的抑制、凋亡作用及其可能的作用机制。方法：以不同浓度的NVP-BEZ235处理体外人结直肠癌细胞株SW480，分别用MTT法、流式细胞术和Western blot法检测NVP-BEZ235对SW480细胞的增殖抑制作用、细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的表达。结果：NVP-BEZ235对人结直肠癌细胞株SW480的生长具有显著的抑制活性，诱导其凋亡，抑制p-Akt、p-p70S6K蛋白的表达，且均与药物浓度和作用时间呈正相关。结论：NVP-BEZ235具有抑制人结直肠癌细胞株SW480的生长作用并诱导其凋亡，且机制可能是通过抑制p-Akt、p-p70S6K蛋白的表达来实现的。

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，目前，传统的治疗手段包括手术、化疗和放疗，但对于肠癌患者生存期没有明显改善，中位生存期不足20个月[1]。近年来，随着分子靶向药物的出现，例如针对表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体对肠癌晚期患者有明显疗效，使其中位生存期达到2年[2]，但由于KRAS等的突变导致抗-EGFR单克隆抗体耐药的发生使得该靶向药物治疗效果大大降低。因此，寻找新的治疗靶点已成为治疗结直肠癌的关键。NVP-BEZ235是一种新型的PI3K和mTOR双重抑制剂，可竞争性结合ATP结合位点，特异性地抑制PI3K和mTOR的活性[3]。本文以结直肠癌细胞株SW480为研究对象，在细胞增殖、细胞凋亡以及细胞周期等方面研究NVP-BEZ235对结直肠癌的生长抑制作用，以及相关机制。

材料与方法

1 材 料 NVP-BEZ235购自Selleck Chemicals公司(Houston，TX，USA)，人结直肠癌细胞株SW480购于美国ATCC细胞库，Hoechst 33342购自美国Sigma公司，BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo Fisher公司，Annexin V/PI 双染凋亡试剂盒购于Invitrogen公司，AKT磷酸化抗体购自CST，ECL显色液购自Thermo Scientific公司。

2 实验方法 ①SW480细胞株培养：培养在10%的灭菌牛血清+50 U/ml青霉素+50 U/ml链霉素的RP-M11640的培养液中。置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。NVP-BEZ235的配制，NVP-BEZ235的CAS号为915019-65-7，分子式C30H23N5O，分子量469.6，称取0.939 mg NVP-BEZ235溶解于100 ml DMSO中，配制20 μmol/L储存液待用。②MTT法检测NVP-BEZ235对SW480细胞的增殖抑制作用[4]：收集对数生长期SW480细胞，将细胞以100 μl/well接种于96孔板，使待测细胞密度为1×104/孔。5%CO2，37 ℃孵育12 h后，吸弃上清，然后加入不同浓度的NVP-BEZ235(0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 μmol/L)，分别设3个复孔。孵育72 h后，每孔加入20 μl 的5 mg/ml 浓度的MTT溶液。继续37 ℃培养4 h后，弃孔内培养基，每孔再加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，置低速摇床上振荡10 min，将试剂对照调零。用酶联免疫检测仪于490 nm处检测各孔的吸光值。以下面公式计算细胞生存率：细胞生存率= (OD药物作用孔-OD调零孔)/(OD对照孔-OD调零孔)×100%。以不同浓度的NVP-BEZ235为横坐标，细胞抑制率为纵坐标，绘制细胞增殖抑制曲线图。③流式细胞术检测细胞凋亡率：6孔板中接种5×105个/ml的对数生长期SW480细胞，贴壁培养12 h后，在加药组中分别加入1、5、10 μmol/L的NVP-BEZ235，对照组中加入等量的DMSO，在37℃、5%CO2条件下培养48 h，弃培养基，参考凋亡检测试剂盒实验操作说明：胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞两遍，用500 μl的1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μl的Annexin- V和10 μl的 PI，冰上避光15 min后，流式细胞仪上机分析。④Western Blot检测细胞中有关蛋白的表达：收集对数生长期SW480细胞，按1×106接种至6 cm细胞培养皿，待细胞长到90%饱和时。分别用不同浓度的NVP-BEZ235(0.5、1、5、10 μmol/L)处理细胞，在5 %CO2、37 ℃培养箱中培养48 h，用预冷的PBS洗细胞两遍后加入RIPA细胞裂解液(含10%蛋白酶抑制剂)，冰上放置30 min，期间摇晃2～3次。4℃，13000 g，离心20 min，收集上清，按BCA蛋白定量试剂盒操作说明进行蛋白浓度定量检测。SDS凝胶每样本加入20 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，在转移至PVDF膜上，5%BSA室温封闭3 h，加抗体(Caspase-8抗体、Caspase-3抗体、Akt抗体、p-Akt抗体、p70S6K抗体、p-p70S6K1抗体，1∶1000稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜10 min×3次后，加入HRP偶联的二抗(1∶10000稀释)，室温孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次后，加入ECL显色试剂于Bio-Rad ChemiDox XRS扫膜仪上扫描目的蛋白的表达。

结 果

1 MTT法检测NVP-BEZ235对SW480细胞的增殖抑制作用 见图1。NVP-BEZ235能显著抑制人结直肠癌细胞SW480的增殖，且随着NVP-BEZ235浓度的增加和作用时间的延长，抑制效果更为显著，即抑制率与药物浓度-时间呈正相关，在72、96 h，NVP-BEZ235对SW480的IC50值分别为9.1和4.9 μmol/L。

图1 不同浓度的NVP-BEZ235对SW480细胞的生长抑制作用

2 流式细胞术和Western blot检测BEZ235诱导细胞发生凋亡 见表1、2。采用0、0.5、1.0、5.0、10 μmol/L浓度的NVP-BEZ235分别处理SW480细胞48 h。单因素方差分析显示，各浓度组间细胞凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.05)。LSD-t检验显示，5、10 μmol/L浓度组细胞凋亡率均显著大于0 μmol/L浓度组(P<0.05)。Western blot检测显示，各浓度组间细胞Caspase-8、Caspase-3表达比较差异有统计学意义(P<0.05)，LSD-t检验显示，1、5、10 μmol/L浓度组细胞Caspase-8、Caspase-3表达均显著大于0 μmol/L浓度组(P<0.05)。

表1 不同浓度NVP-BEZ235对SW480细胞凋亡的影响

注：与0 μmol/L比较，*P<0.05

表2 不同浓度NVP-BEZ235对SW480细胞Caspase-8、Caspase-3表达的影响

注：与0 μmol/L比较，*P<0.05

3 Western blot法检测NVP-BEZ235对Akt、p-Akt、p70S6K、p-p70S6K蛋白的影响 见表3。采用0、0.5、1、5、10 μmol/L浓度的NVP-BEZ235处理人结肠癌细胞SW480，48 h后采用Western blot检测Akt、p-Akt、p70S6K、p-p70S6K表达。单因素方差分析显示，各浓度组间Akt和p70S6K蛋白表达无统计学差异(P>0.05)，而各浓度组间p-Akt和p-p70S6K表达存在统计学差异(P<0.05)。LSD-t检验显示，5、10 μmol/L浓度组细胞p-Akt和p-p70S6K表达均显著小于0 μmol/L浓度组(P<0.05)。

表3 不同浓度NVP-BEZ235对SW480细胞Akt、p-Akt、p70S6K、p-p70S6K表达的影响

注：与0 μmol/L比较，*P<0.05

讨 论

NVP-BEZ235为咪唑喹啉类抗肿瘤化合物，主要作用于PI3K/mTOR信号通路。杨芬等[5]通过MTT法、Western blot法、DAPI染色法及TUNEL染色法研究发现，NVP-BEZ235可通过抑制PI3K/mTOR下游通路磷酸化过程达到选择性的抑制鼻咽癌细胞的增值和诱导其凋亡。另有文献报道，NVP-BEZ235可通过抑制PI3K/mTOR通路相关蛋白的表达，从而抑制淋巴瘤细胞(CA46、RAJI)、骨肉瘤细胞(MG-63、U2OS、SaOs-2)及突变乳腺癌细胞(MDA-MB361、MCF-7)的增值，并诱导癌细胞的凋亡[6-7]。

临床研究表明，人结直肠癌中PI3K/AKT/mTOR信号通路的主要异常是PIK3CA基因突变以及PTEN表达的丢失，而PIK3CA突变与结直肠癌分化程度、病理类型有着密切的关系[8]。目前用于结直肠癌患者的靶向药物主要为奥沙利铂、卡培他滨等，虽具有一定疗效，但副作用较大[9]。本课题探究了NVP-BEZ235对体外人结直肠癌细胞SW480的生长抑制及其可能的作用机制。实验显示，不同浓度的NVP-BEZ235对SW480细胞均具有抑制作用，且随着剂量、作业时间增加，抑制作用也随之增强。说明NVP-BEZ235 可以明显抑制SW480细胞生长，并与剂量呈正相关。

细胞凋亡是一个受精确调控的程序性死亡的过程，研究已证实细胞凋亡与肿瘤的发生密不可分[10]。本研究采用流式细胞法，探究了不同剂量的NVP-BEZ235(0、0.5、1、5、10 μmol/L)对SW480细胞处理48 h后凋亡的情况。结果显示，0.5～10 μmol/L 的NVP-BEZ235均可诱导SW480细胞发生凋亡，且随着NVP-BEZ235浓度的增加，诱导凋亡效应增强，其中5、10 μmol/L的 NVP-BEZ235浓度对SW480凋亡率与0 μmol/L相比具有统计学差异。Caspase家族在正常的细胞中处于无活性状态，而在细胞的凋亡过程中异常表达。本实验通过Western blot法检测发现，随着NVP-BEZ235浓度的增加，SW480中凋亡启动因子Caspase-8和执行因子Caspase-3的表达增强。说明NVP-BEZ235可能是通过活化Caspase-8，继而活化Caspase-3来完成诱导细胞凋亡的。本研究也发现，NVP-BEZ235可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路中的关键蛋白p-70S6K、p-Akt的表达，且与浓度呈正相关。

总之，通过本研究显示，新型的PI3K和mTOR双重抑制剂NVP-BEZ235对体外人结直肠癌细胞SW480的生长具有显著的抑制作用，且促进其凋亡，可能是通过PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的，具体的作用机制后期将会更深入的研究。

[1] Van CE，Verheul HM，Flamen P，etal.Imaging in Colorectal Cancer: Progress and Challenges for the Clinicians[J]. Cancers，2016，8(9):81-89.

[2] 丁 琦，孙国平.阿司匹林在结直肠癌防治中的研究进展[J].安徽医药，2016，20(10)：1827-1831.

[3] Seiichi O，Tetsuzo T，Yuko T，etal. Efficacy of the dual PI3K and mTOR inhibitor NVP-BEZ235 in combination with nilotinib against BCR-ABL-positive leukemia cells involves the ABL kinase domain mutation[J]. Cancer BiolTher，2014，15(2)：207-215.

[4] 何 浪，李国军，刘光波，等.MTT法和WST-8法检测三羟异黄酮对SW480细胞生长抑制的比较[J].重庆医学，2011，40(26)：2671-2672.

[5] 杨 芬，唐晓燕，吴 鹏，等.PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235体内外对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响[J].南京医科大学学报：自然科学版，2016，36(5):569-576.

[6] Li C，Xin P，Xiao H，etal.The dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 inhibits proliferation and induces apoptosis of burkitt lymphoma cells[J]. Cancer Cell Int，2015，15(1):65-74.

[7] Zhu YR，Min H，Fang JF，etal. Activity of the novel dual phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor NVP-BEZ235 against osteosarcoma[J]. Cancer BiolTher，2015，16(4):1-8.

[8] Janku F，Hong DS，Fu S，etal.Assessing PIK3CA and PTEN in early-phase trials with PI3K/AKT/mTORinhibitors[J]. Cell Rep，2014，6(2)：377-387.

[9] 李凌云，解 华，张 宁，等.奥沙利铂分别联合卡培他滨和替吉奥治疗晚期结直肠癌的临床疗效分析[J].安徽医药，2016，20(8)：1570-1572.

[10] 韦 勇，杨四军.细胞自噬的调控与自噬程序性死亡的研究进展[J].国际免疫学杂志，2016，39(5):493-497.

(收稿：2017-04-10)

InhibitoryandmechanismofNVP-BEZ235onproliferationofhumancoloncancercelllineSW480

Ma Shanyi，Sun Zhaolou.

Department of Oncology， Xuancheng Central Hospital in Anhui Province(Xuancheng 242000)

Objective：To study the effect of NVP-BEZ235 on proliferation of human colon cancer cell line SW480 and its mechanism. Methods：The human colon cancer cell line SW480 were treated with different concentrations of NVP-BEZ235. Proliferation，apoptosis and mechanism of SW480 cells were detected by MTT assay，cells cycle and western blot. Results：NVP-BEZ235 significantly inhibited the growth of SW480 cells and promote the apoptosis of SW480 cells in a time-dependent and dose-dependent manner. Western Blot experiments showed that NVP-BEZ235 could effectively inhibit p-Akt、p-p70S6K protein expression of SW480 cells. Conclusion：NVP-BEZ235 can inhibited SW480 cells proliferation and induce apoptosis. The mechanism may be related to down-regulated of p-Akt、p-p70S6K protein expression.

Colorectal neoplasms Cell enlargement Apoptosis @NVP-BEZ235

结直肠肿瘤 细胞增长 细胞凋亡 @NVP-BEZ235

R735.37

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.013